Войти
Протеин C, также известный как автопротромбин IIA и фактор свертывания крови XIX, представляет собой зимоген, активированная форма которого играет важную роль в регулировании антикоагуляции, воспаления, и гибель клеток и поддержание проницаемости стенок кровеносных сосудов у людей и других животных. Активированный протеин C (APC ) выполняет эти операции, главным образом, протеолитически инактивируя белки Фактор V a и Фактор VIII a. APC классифицируется как сериновая протеаза, поскольку он содержит остаток из серина в своем активном сайте. У людей протеин C кодируется геном PROC , который находится на хромосоме 2.
Зимогенная форма протеина C является витамин K -зависимой гликопротеин, циркулирующий в плазме крови. Его структура представляет собой двухцепочечный полипептид, состоящий из легкой цепи и тяжелой цепи, соединенных дисульфидной связью. Зимоген протеина C активируется, когда он связывается с тромбином, другим белком, сильно участвующим в свертывании крови, и активации протеина C в значительной степени способствует присутствие тромбомодулина и эндотелиального протеина C рецепторы (EPCR). Из-за роли EPCR активированный протеин C находится в основном возле эндотелиальных клеток (то есть тех, которые составляют стенки кровеносных сосудов), и именно на эти клетки и лейкоциты (белые кровяные тельца) влияет APC. Из-за решающей роли, которую протеин C играет как антикоагулянт, люди с дефицитом протеина C или некоторой устойчивостью к APC страдают от значительно повышенного риска образования опасных тромбов (тромбоз ).
Исследование клинического применения рекомбинантной формы активированного протеина С человека (rhAPC), известной как дротрекогин альфа-активированный, под торговой маркой Xigris, разработанной Eli Lilly и Компания была окружена спорами. Eli Lilly провела агрессивную маркетинговую кампанию по продвижению его использования для людей с тяжелым сепсисом и септическим шоком и спонсировала 2004 Surviving Sepsis Campaign Guidelines. Однако в Кокрановском обзоре 2012 г. было обнаружено, что его использование не может быть рекомендовано, поскольку оно не улучшает выживаемость и не увеличивает риск кровотечения. В октябре 2011 года компания Eli Lilly отозвала Xigris с рынка из-за более высокой смертности в исследовании среди взрослых.
Роль протеина C антикоагулянтом в организме человека была впервые отмечена Seegers et al. в 1960 году, который дал протеину C его первоначальное название - автопротромбин II-a. Белок С был впервые выделен Йоханом Стенфло из коровьего плазмы в 1976 году, и Стенфло определил, что это витамин К-зависимый белок. Он назвал его протеином C, потому что это был третий протеин («пик C»), который элюировался с ионообменной хроматографии DEAE-Sepharose . В то время Сигерс занимался поиском витамин К-зависимых факторов свертывания, не обнаруженных анализами свертывания, которые измеряют общую функцию свертывания. Вскоре после этого Сигерс признал, что открытие Стенфло совпадает с его собственным. Активированный протеин C был открыт позже в том же году, а в 1977 году было впервые обнаружено, что APC инактивирует фактор V a. В 1980 году Вехар и Дэви обнаружили, что APC также инактивирует фактор VIII a, и вскоре после этого протеин S был признан Уокером кофактором. В 1982 году семейное исследование Griffin et al. впервые связал дефицит протеина C с симптомами венозного тромбоза. Гомозиготный дефицит протеина С и связанные с этим серьезные последствия для здоровья были описаны в 1984 году несколькими учеными. Клонирование кДНК протеина C было впервые выполнено в 1984 г. Beckmann et al. который создал карту гена, ответственного за выработку протеина С в печени. В 1987 году был проведен плодотворный эксперимент (Taylor et al.), В ходе которого было продемонстрировано, что активированный протеин C предотвращает коагулопатию и смерть павианов , зараженных летальными концентрациями E. coli.
В 1993 году наследственная устойчивость к APC была обнаружена Dahlbäck et al. и связанный с семейной тромбофилией. В 1994 году была отмечена относительно распространенная генетическая мутация, которая продуцирует фактор V Leiden (Bertina et al.). Двумя годами позже Gla-domainless APC был визуализирован с разрешением 2,8 Ангстремса. Начиная с клинического исследования PROWESS в 2001 году, было признано, что многие симптомы сепсиса могут быть уменьшены путем инфузии APC, а уровень смертности пациентов с сепсисом может быть значительно снижен. Ближе к концу того же года дротрекогин альфа (активированный), рекомбинантный человеческий активированный протеин C, стал первым препаратом, одобренным US FDA для лечения тяжелого сепсиса. В 2002 году Science опубликовала статью, в которой впервые было показано, что протеин C активирует протеазно-активируемый рецептор-1 (PAR-1), и этот процесс объясняет модуляцию протеина иммунной системы. 63>
Биологические инструкции по синтезу протеина C у людей закодированы в гене, официально названном «протеин C (инактиватор факторов свертывания крови Va и VIIIa)». Символ гена, одобренный Комитетом по номенклатуре генов HUGO, - "PROC" из "pro tein C ". Он расположен на второй хромосоме (2q13-q14) и включает девять экзонов. Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий протеин C, составляет приблизительно 11000 оснований.
Человеческий протеин C представляет собой витамин K-зависимый гликопротеин, структурно подобный другим витамин K-зависимым протеинам, влияющим на свертывание крови., такие как протромбин, фактор VII, фактор IX и фактор X. Синтез протеина С происходит в печени и начинается с одноцепочечной молекулы-предшественника: 32-аминокислотного N-конца сигнального пептида, предшествующего пропептиду. Белок C образуется при удалении дипептида Lys и Arg; это вызывает превращение в гетеродимер с N-связанными углеводами на каждой цепи. Белок имеет одну легкую цепь (21 кДа ) и одну тяжелую цепь (41 кДа), соединенные дисульфидной связью между Cys и Cys.
Домен структура препропротеина C (вверху) и зрелого гетеродимера (внизу). Неактивный протеин C содержит 419 аминокислот в нескольких доменах : один домен Gla (остатки 43–88); спиральный ароматический сегмент (89–96); два домена эпидермального фактора роста (EGF) (97–132 и 136–176); активационный пептид (200–211); и трипсин -подобный домен сериновой протеазы (212–450). Легкая цепь содержит Gla- и EGF-подобные домены и ароматический сегмент. Тяжелая цепь содержит домен протеазы и пептид активации. Именно в этой форме 85–90% протеина С циркулирует в плазме в виде зимогена, ожидающего своей активации. Оставшийся зимоген протеина С представляет собой слегка модифицированные формы протеина. Активация фермента происходит, когда молекула тромбина отщепляет активирующий пептид от N-конца тяжелой цепи. Активный сайт содержит каталитическую триаду, типичную для сериновых протеаз (His, Asp и Ser).
Домен Gla особенно полезен для связывания с отрицательно заряженными фосфолипидами для антикоагуляции и EPCR для цитопротекции. Один конкретный экзосайт увеличивает способность протеина C эффективно инактивировать фактор V a. Другой необходим для взаимодействия с тромбомодулином.
Активации протеина C сильно способствует тромбомодулин и рецептор эндотелиального протеина C (EPCR), последний из которых обнаруживается в основном на эндотелиальных клетках (клетках внутри кровеносных сосудов). Присутствие тромбомодулина ускоряет активацию на несколько порядков, а EPCR ускоряет активацию в 20 раз. Если какой-либо из этих двух белков отсутствует в образцах мышей, мышь умирает от чрезмерного свертывания крови, пока все еще в эмбриональном состоянии. На эндотелии APC выполняет главную роль в регулировании свертывания крови, воспаления и гибели клеток (апоптоз ). Из-за ускоряющего действия тромбомодулина на активацию протеина C можно сказать, что протеин активируется не тромбином, а комплексом тромбин-тромбомодулин (или даже тромбин-тромбомодулин-EPCR). Находясь в активной форме, APC может оставаться, а может и не оставаться связанным с EPCR, к которому он имеет примерно такое же сродство, что и белковый зимоген.
Белок C в зимогене присутствует у нормального взрослого человека. человеческая плазма крови в концентрациях 65–135 IU /dL. Активированный протеин C обнаруживается на уровнях примерно в 2000 раз ниже этого. Умеренный дефицит протеина C соответствует уровню в плазме выше 20 МЕ / дл, но ниже нормы. Умеренно серьезные дефициты описывают концентрации в крови от 1 до 20 МЕ / дл; при серьезной недостаточности уровень протеина C ниже 1 МЕ / дл или не обнаруживается. Уровни протеина C у здорового доношенного ребенка в среднем 40 МЕ / дл. Концентрация протеина C увеличивается до шести месяцев, когда средний уровень составляет 60 МЕ / дл; уровень остается низким в детстве, пока не достигнет уровня взрослых после подросткового возраста. период полужизни активированного протеина C составляет около 15 минут.
Пути протеина C представляют собой специфические химические реакции, которые контролируют уровень экспрессии APC и его активность в организме. Белок C плейотропный, с двумя основными классами функций: антикоагулянт и цитопротекция (его прямое действие на клетки). Какую функцию выполняет белок C, зависит от того, остается ли APC связанным с EPCR после его активации; антикоагулянтные эффекты APC возникают, когда это не так. В этом случае протеин C действует как антикоагулянт, необратимо протеолитически инактивируя фактор V a и фактор VIII a, превращая их в фактор V i и фактор VIII i соответственно. Когда все еще связан с EPCR, активированный протеин C выполняет свои цитопротекторные эффекты, воздействуя на эффектор субстрат PAR-1, рецептор-1, активируемый протеазой. В некоторой степени антикоагулянтные свойства APC не зависят от его цитопротективных свойств, поскольку на экспрессию одного пути не влияет существование другого.
Активность протеина C может быть подавлена за счет уменьшения количества доступного тромбомодулина или EPCR. Это может происходить с помощью воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли-α (TNF-α). Активированные лейкоциты высвобождают эти медиаторы воспаления во время воспаления, ингибируя образование как тромбомодулина, так и EPCR, и вызывая их отхождение с эндотелиальной поверхности. Оба эти действия подавляют активацию протеина С. Сам тромбин также может влиять на уровни EPCR. Кроме того, белки, высвобождаемые из клеток, могут препятствовать активации протеина C, например, эозинофил, что может объяснять тромбоз при гиперэозинофильной болезни сердца. Белок C может быть активирован с помощью фактора тромбоцитов 4. Предполагается, что этот цитокин улучшает активацию протеина C за счет образования электростатического мостика от домена Gla протеина C к домену гликозаминогликана (GAG) тромбомодулина, уменьшая константу Михаэлиса (KM) за их реакцию. Кроме того, протеин C ингибируется ингибитором протеина C.
Свертывание крови и путь антикоагуляции протеина C Белок C является основным компонентом антикоагуляции в организме человека. Он действует как сериновая протеаза зимоген : APC протеолизирует пептидные связи в активированном Факторе V и Факторе VIII (Фактор V a и фактор VIII a), и одна из аминокислот в связи представляет собой серин. Эти белки, которые инактивируют APC, фактор V a и фактор VIII a, являются высокопрокоагулянтными кофакторами при образовании тромбина, который является важным элементом свертывания крови. ; вместе они являются частью протромбиназного комплекса. Кофакторы инактивации фактора V a и фактора VIII a включают белок S, фактор V, липопротеин высокой плотности, анионный фосфолипиды и гликосфинголипиды.
Фактор V a связывается с протромбином и фактором X a, увеличивая скорость, с которой тромбин произведено на четыре порядка (10,000x). Таким образом, инактивация фактора V a практически останавливает производство тромбина. Фактор VIII, с другой стороны, является кофактором в производстве активированного фактора X, который, в свою очередь, превращает протромбин в тромбин. Фактор VIII a увеличивает активацию фактора X примерно в 200000 раз. Из-за его важности для свертывания крови фактор VIII также известен как антигемофильный фактор, а недостаток фактора VIII вызывает гемофилию A.
APC инактивирует фактор V a, делая три расщепления (Arg, Арг, Арг). Расщепления как по Arg, так и по Arg уменьшают притяжение молекулы к фактору X a, и, хотя первый из этих сайтов расщепляется медленно, это полностью необходимо для функционирования фактора V. Белок S помогает этому. процесс путем катализа протеолиза на Arg, в котором домен А2 фактора V диссоциирует от остальной части белка. Белок S также связывается с фактором X a, препятствуя последнему уменьшению инактивации APC фактора V a.
. Инактивация фактора VIII a не так хорошо изучена. Период полувыведения фактора VIII a составляет всего около двух минут, если фактор IX a не присутствует для его стабилизации. Некоторые ставят под сомнение значимость инактивации APC фактора VIII a, и неизвестно, в какой степени фактор V и белок S являются кофакторами в его протеолизе. Известно, что APC воздействует на фактор VIII a, расщепляя два сайта, Arg и Arg, любого из которых достаточно для отключения фактора VIII a и преобразования его в фактор VIII <450.>Цитопротективные эффекты
Когда APC связан с EPCR, он выполняет ряд важных цитопротективных (то есть клеточно-защитных) функций, большинство из которых, как известно, требует EPCR и PAR-1. К ним относятся регуляция экспрессии генов, противовоспалительные эффекты, антиапоптотические эффекты и защита функции эндотелиального барьера.
Обработка клеток APC демонстрирует, что модуляция экспрессии его гена эффективно контролирует основные пути воспалительного и апоптотического поведения. Существует около 20 генов, которые активируются протеином C, и 20 генов, которые подавляются: первые обычно являются противовоспалительными и антиапоптотическими путями, а вторые имеют тенденцию быть провоспалительными и проапоптотическими. Механизмы APC для изменения профилей экспрессии генов не совсем понятны, но считается, что они, по крайней мере, частично включают ингибирующее действие на активность фактора транскрипции . Важные белки, которые активирует APC, включают Bcl-2, eNOS и IAP. APC оказывает значительное подавление регуляции p53 и Bax.
APC оказывает противовоспалительное действие на эндотелиальные клетки и лейкоциты. APC воздействует на эндотелиальные клетки, ингибируя высвобождение медиатора воспаления и подавляя молекулы сосудистой адгезии. Это снижает адгезию лейкоцитов и их инфильтрацию в ткани, а также ограничивает повреждение подлежащих тканей. APC поддерживает функцию эндотелиального барьера и снижает хемотаксис. APC ингибирует высвобождение медиаторов воспалительного ответа в лейкоцитах, а также в эндотелиальных клетках за счет снижения цитокинового ответа и, возможно, уменьшения системного воспалительного ответа, как это наблюдается при сепсисе. Исследования как на крысах, так и на людях показали, что APC снижает эндотоксин -индуцированное повреждение и воспаление легких.
Ученые признают антиапоптотические эффекты активированного протеина С, но неясны точные механизмы, с помощью которых происходит апоптоз. заблокирован. Известно, что APC является нейропротекторным. Антиапоптоз достигается за счет уменьшения активации каспазы 3 и каспазы 8, улучшенного соотношения Bax / Bcl-2 и подавления p53.
Активированный протеин C также обеспечивает большая защита функции эндотелиального барьера. Нарушение эндотелиального барьера и соответствующее увеличение проницаемости эндотелия связаны с набуханием, гипотонией и воспалением, всеми проблемами сепсиса. APC защищает функцию эндотелиального барьера, индуцируя PAR-1-зависимую сфингозинкиназу-1 активацию и активируя сфингозин-1-фосфат с помощью сфингозинкиназы.
Несколько исследований показали что протеолитическая активность APC способствует наблюдаемым цитопротекторным свойствам APC, но протеолитически неактивные варианты также способны регулировать образование PAR-активаторов тромбина и фактора Ха и проявлять цитопротекторные свойства in vitro и in vivo.
Генетический дефицит протеина C в его легкой форме, связанный с простой гетерозиготностью, вызывает значительно повышенный риск венозного тромбоза у взрослых. Если плод гомозиготен или составной гетерозиготный в отношении дефицита, может быть проявление молниеносной пурпуры, тяжелой диссеминированной внутрисосудистой коагуляции и одновременная венозная тромбоэмболия в утробе матери; это очень тяжело и обычно приводит к летальному исходу. Делеция гена протеина C у мышей вызывает гибель плода примерно во время рождения. Плодные мыши без протеина C сначала развиваются нормально, но испытывают сильное кровотечение, коагулопатию, отложение фибрина и некроз печени.
Частота дефицита протеина C среди бессимптомных людей составляет от 1 из 200 до 1 из 500. Напротив, значительные симптомы дефицита выявляются у 1 из 20 000 человек. Никаких расовых или этнических предубеждений обнаружено не было.
Активная резистентность к протеину C возникает, когда APC не может выполнять свои функции. Это заболевание имеет симптомы, похожие на симптомы дефицита протеина С. Наиболее распространенная мутация, приводящая к устойчивости к активированному протеину C среди кавказцев, находится в сайте расщепления фактора V для APC. Там Arg заменяется Gln, производя Фактор V Лейден. Эта мутация также называется R506Q. Мутация, приводящая к потере этого сайта расщепления, фактически не дает APC эффективно инактивировать как фактор V a, так и фактор VIII a. Таким образом, у человека слишком быстро сворачивается кровь, и он постоянно подвергается повышенному риску тромбоза. Лица, гетерозиготные по мутации Фактора V Лейдена, несут риск венозного тромбоза в 5-7 раз выше, чем в общей популяции. Гомозиготные субъекты имеют риск в 80 раз выше. Эта мутация также является наиболее частым наследственным риском венозного тромбоза среди европеоидов.
Около 5% устойчивости к APC не связаны с вышеуказанной мутацией и фактором V Leiden. Другие генетические мутации вызывают резистентность к APC, но не в такой степени, как фактор V Leiden. Эти мутации включают различные другие версии фактора V, спонтанное образование аутоантител, нацеленных на фактор V, и дисфункцию любого из кофакторов APC. Кроме того, некоторые приобретенные состояния могут снизить эффективность APC в выполнении своих антикоагулянтных функций. Исследования показывают, что от 20% до 60% пациентов с тромбофилией страдают той или иной формой резистентности к APC.
Варфарин-некроз - это приобретенный дефицит протеина C из-за лечения варфарином, который является витамином K антагонист и сам антикоагулянт. Однако лечение варфарином может вызывать парадоксальные поражения кожи, подобные тем, которые наблюдаются при молниеносной пурпуре. Вариант этой реакции проявляется в виде венозной конечности гангрены, когда варфарин используется для лечения тромбоза глубоких вен, связанного с раком. В этих ситуациях варфарин может быть возобновлен в низкой дозировке, чтобы гарантировать отсутствие дефицита протеина C до того, как будут подавлены факторы свертывания крови II, IX и X витамина K.
Активированный протеин C расщепляет Plasmodium falciparum гистоны, которые высвобождаются во время инфекции: расщепление этих гистонов устраняет их провоспалительные эффекты.
В ноябре 2001 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов одобрило Дротрекогин альфа-активированный (DrotAA) для клинического лечения взрослых, страдающих тяжелым сепсисом и с высоким риском смерти. Альфа-активированный дротрекогин представляет собой рекомбинантную форму активированного протеина С человека (rhAPC). Eli Lilly and Company продает его как Xigris.,
Дротрекогин альфа-активированный был предметом значительных споров, поскольку он был одобрен для клинического использования, поскольку было обнаружено, что он увеличивает кровотечение, а не снижает смертность. В октябре 2011 года RhAPC (Xigris®) был снят с продажи компанией Eli Lilly из-за более высокой смертности в ходе исследования среди взрослых.
APC был изучен как способ лечения повреждения легких, после того, как исследования показали, что у пациентов с травмой легких снижение уровней APC в определенных частях легких коррелирует с худшими результатами. APC также рассматривался для использования для улучшения результатов лечения пациентов в случаях ишемического инсульта, неотложной медицинской помощи, при которой артериальная блокада лишает область мозга кислорода, вызывая гибель тканей. Многообещающие исследования показывают, что APC можно сочетать с единственным в настоящее время одобренным лечением тканевым активатором плазминогена (tPA), чтобы защитить мозг от очень вредных побочных эффектов tPA, в дополнение к предотвращению клеточного смерть от недостатка кислорода (гипоксия ). Также было предложено клиническое использование APC для улучшения результатов трансплантации островков поджелудочной железы при лечении диабета I типа.
