Авидин | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
мутант стрептавидина ядра d128a при pH 4,5 | |||||||||
Идентификаторы | |||||||||
Символ | Авидин | ||||||||
Pfam | PF01382 | ||||||||
InterPro | IPR005468 | ||||||||
PROSITE | PDOC00499 | ||||||||
SCOPe | 1slf / SUPFAM | ||||||||
|
Авидин является тетрамерный биотин -связывающий белок, продуцируемый в яйцеводах птиц, рептилий и земноводных и отложились в белках своих яиц. Димерные члены семейства авидинов также обнаруживаются в некоторых бактериях. В курином яичном белке авидин составляет примерно 0,05% от общего белка (примерно 1800 мкг на яйцо). Тетрамерный белок содержит четыре идентичных субъединицы (гомотетрамер), каждая из которых может связываться с биотином (витамин B 7, витамин H) с высокой степенью сродства. и специфичность. Константа диссоциации комплекса авидин-биотин составляет K D ≈ 10 M, что делает его одной из самых прочных известных нековалентных связей.
In размер его тетрамерной формы, авидина, оценивается в 66–69 тыс. Да. 10% молекулярной массы приходится на углевод, состоящий из четырех-пяти маннозы и трех N-ацетилглюкозаминовых остатков. углеводные части авидина содержат по крайней мере три уникальных олигосахаридных структурных типа, которые схожи по структуре и составу.
Функциональный авидин обнаружен только в сырых яйцах, так как сродство белка к биотину разрушается при варке. Естественная функция авидина в яйцах неизвестна, хотя постулируется, что он вырабатывается в яйцеводах как ингибитор роста бактерий, связывая биотин, полезный для роста бактерий. Доказательством этого является то, что стрептавидин, слабо связанный белок с равным сродством к биотину и очень похожим сайтом связывания, вырабатывается некоторыми штаммами бактерий Streptomyces и, как полагают, служит для ингибирования рост конкурирующих бактерий, как антибиотик.
. Не- гликозилированная форма авидина была выделена из коммерчески полученного продукта; однако неясно, существует ли негликозилированная форма в природе или является продуктом производственного процесса.
Авидин был открыт Эсмондом Эмерсоном Снеллом (1914–2003). Это открытие началось с наблюдения, что цыплятам, соблюдающим диету из сырого яичного белка, не хватало биотина, несмотря на наличие витамина в их рационе. Был сделан вывод о том, что компонент яичного белка секвестировал биотин, что Снелл подтвердил in vitro с помощью теста дрожжей. Позже Снелл выделил компонент яичного белка, ответственный за связывание биотина, и в сотрудничестве с Полом Гьорги подтвердил, что выделенный яичный белок был причиной дефицита биотина или «повреждения яичного белка». В то время этот белок был предварительно назван авидальбумином (буквально «голодный альбумин») исследователями из Техасского университета. Позднее название белка было изменено на «авидин» на основании его сродства к биотину (авид + биотин).
Исследования 1970-х годов помогли установить систему авидин-биотин. как мощный инструмент в биологических науках. Осознавая силу и специфичность комплекса авидин-биотин, исследователи начали использовать авидин и стрептавидин в качестве зондов и матриц сродства в многочисленных исследовательских проектах. Вскоре после этого исследователи Байер и Вильчек разработали новые методы и реагенты для биотинилирования антител и других биомолекул, что позволило использовать систему авидин-биотин для различных биотехнологических приложений. Сегодня авидин используется в самых разных областях, от исследований и диагностики до медицинских устройств и фармацевтических препаратов.
Сродство авидина к биотину используется в широком спектре биохимических анализов, включая вестерн-блот, ELISA, ELISPOT и pull- вниз анализов. В некоторых случаях использование биотинилированных антител позволило заменить антитела, меченные радиоактивным йодом, в системах радиоиммуноанализа, чтобы получить нерадиоактивную систему анализа.
Также используется авидин, иммобилизованный на твердых носителях. в качестве среды очистки для захвата меченного биотином белка или молекул нуклеиновой кислоты. Например, белки клеточной поверхности могут быть специфически помечены мембранно-непроницаемым биотиновым реагентом, а затем специфически захвачены с использованием носителя на основе авидина.
В качестве основного заряженного гликопротеина авидин проявляет неспецифическая привязка в некоторых приложениях. Нейтравидин, дегликозилированный авидин с модифицированными аргининами, демонстрирует более нейтральную изоэлектрическую точку (pI) и доступен в качестве альтернативы нативному авидину, когда возникают проблемы неспецифического связывания. Дегликозилированные нейтральные формы авидина доступны через Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin) и e-Proteins (NeutraLite).
Учитывая прочность связи авидин-биотин, диссоциация комплекса авидин-биотин требует экстремальных условий, вызывающих денатурацию белка. Необратимая природа комплекса авидин-биотин может ограничивать применение авидина в приложениях аффинной хроматографии, где желательно высвобождение захваченного лиганда. Исследователи создали авидин с обратимыми характеристиками связывания посредством нитрования или йодирования тирозина на сайте связывания. Модифицированный авидин проявляет сильные характеристики связывания биотина при pH 4 и высвобождает биотин при pH 10 или выше. Мономерная форма авидина с пониженным сродством к биотину также используется во многих коммерчески доступных аффинных смолах. Мономерный авидин создается обработкой иммобилизованного нативного авидина мочевиной или гуанидином HCl (6-8 M), что дает более низкую диссоциацию K D ≈ 10M. Это позволяет элюции из матрицы авидина происходить в более мягких, неденатурирующих условиях, с использованием низких концентраций биотина или условий низкого pH. Для единственного высокоаффинного сайта связывания биотина без перекрестного сшивания можно использовать моновалентную версию дальнего родственника авидина, стрептавидина.
Термическая стабильность и активность авидина в связывании биотина представляют как практический, так и теоретический интерес для исследователей, поскольку стабильность авидина необычайно высока, а авидин является антинутриентом в пище человека. Исследование 1966 г., опубликованное в Biochemical and Biophysical Research Communications, показало, что структура авидина остается стабильной при температурах ниже 70 ° C (158 ° F). При температуре выше 70 ° C (158 ° F) структура авидина быстро разрушается, а при температуре 85 ° C (185 ° F) обнаруживается значительная потеря структуры и потеря способности связывать биотин. Анализ 1991 для журнала Journal of Food Science обнаружил значительную активность авидина в вареном яичном белке: «средняя остаточная активность авидина в жареном, вареном и вареном (2 мин) яичном белке составляла 33, 71 и 40% активности сырого яичного белка ». В ходе анализа было сделано предположение, что время приготовления было недостаточным для адекватного нагрева всех холодных участков внутри яичного белка. Для полной инактивации способности авидина связывать биотин требовалось кипячение в течение более 4 минут.
Исследование 1992 года показало, что термическая инактивация биотин-связывающей активности авидина описывалась как D 121 ° C = 25 мин и z = 33 ° С. Это исследование не согласуется с предыдущими предположениями, что «сайт связывания авидина разрушается при нагревании. денатурация ".
. Биотин-связывающие свойства авидина были использованы при разработке идрабиотапаринукса, длительно действующего лекарства. молекулярная масса гепарин, используемый для лечения венозного тромбоза. Из-за длительного действия идрапаринукса были высказаны опасения относительно клинического ведения кровотечений. При добавлении биотиновой составляющей к молекуле идрапаринукса образуется идрабиотапаринукс; его антикоагулянтная активность в условиях кровотечения может быть отменена путем внутривенного вливания авидина.