Войти
Вестерн-блот с использованием антитела, которое распознает белки, модифицированные липоевой кислотой вестерн-блоттинг (иногда называемый белковый иммуноблот ) или вестерн-блоттинг - широко используемый аналитический метод в молекулярной биологии и иммуногенетика для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани.
Вкратце, образец подвергается денатурации белка с последующим гель-электрофорезом. Создается синтетическое или животное антитело (известное как первичное антитело ), которое распознает и связывается с конкретным целевым белком. Мембрана для электрофореза промывается раствором, содержащим первичное антитело, перед тем, как смыть избыток антител. Добавляется вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и связывается с ним. Вторичное антитело визуализируется с помощью различных методов, таких как окрашивание, иммунофлуоресценция и радиоактивность, что позволяет косвенно определять конкретный целевой белок.
Другие связанные методы включают дот-блот анализ, количественный дот-блот, иммуногистохимию и иммуноцитохимию, где используются антитела. для обнаружения белков в тканях и клетках с помощью иммуноокрашивания и твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Название вестерн-блоттинг - это игра на Саузерн-блоте, методе обнаружения ДНК, названном в честь его изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна. Точно так же обнаружение РНК называется нозерн-блоттингом. Термин «вестерн-блоттинг» был дан В. Нилом Бернеттом в 1981 году, хотя сам метод зародился в 1979 году в лаборатории Гарри Тобина в Институте Фридриха Мишера в Базеле, Швейцария. В период с 1979 по 2019 год «он упоминался в заголовках, рефератах и ключевых словах более чем 400 000 публикаций, включенных в список PubMed » и, возможно, до сих пор остается наиболее часто используемым методом анализа белков.
Вестерн-блот широко используется в биохимия для качественного обнаружения отдельных белков и модификаций белков (таких как посттрансляционные модификации ). По оценкам, не менее 8-9% всех публикаций, связанных с белками, используют вестерн-блоттинг. Он используется в качестве общего метода для идентификации присутствия конкретного отдельного белка в сложной смеси белков. Полуколичественная оценка белка может быть произведена по размеру и интенсивности цвета полосы белка на мембране блота. Кроме того, применение очищенного белка с известными концентрациями может использоваться для более точной оценки концентрации белка. Вестерн-блоттинг обычно используется для проверки продукции белка после клонирования. Он также используется в медицинской диагностике, например, в тесте на ВИЧ или BSE -тест.
Подтверждающий тест на ВИЧ использует вестерн-блоттинг для обнаружения антител к ВИЧ в образце сыворотки человека. Белки из известных ВИЧ -инфицированных клеток отделяют и наносят на мембрану, как указано выше. Затем тестируемая сыворотка применяется на стадии инкубации первичных антител; свободное антитело смывается и добавляется вторичное антитело против человека, связанное с сигналом фермента. Затем окрашенные полосы указывают белки, к которым сыворотка пациента содержит антитела.
Вестерн-блот также используется в качестве окончательного теста для варианта болезни Крейтцфельда-Якоба, типа прионной болезни, связанной с на употребление в пищу зараженной говядины крупного рогатого скота с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота (коровье бешенство, обычно называемое «коровьим бешенством»).
Другое применение - диагностика туляремии. Оценка способности вестерн-блоттинга выявлять антитела против F. tularensis показала, что его чувствительность составляет почти 100%, а специфичность - 99,6%.
В некоторых формах болезни Лайма используется вестерн-блоттинг.. Вестерн-блоттинг также можно использовать в качестве подтверждающего теста на инфекцию гепатита B и инфекцию HSV-2 (герпес 2 типа). В ветеринарии иногда используют вестерн-блоттинг для подтверждения статуса FIV + у кошек.
Другие применения метода вестерн-блоттинга включают его использование Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА). Кровяной допинг - это неправильное использование определенных методов и / или веществ для увеличения массы красных кровяных телец, что позволяет телу доставлять больше кислорода к мышцам и, следовательно, повышать выносливость и работоспособность. Существует три широко известных вещества или метода, используемых для допинга крови, а именно, эритропоэтин (ЭПО), синтетические переносчики кислорода и переливание крови. Каждый из них запрещен Списком запрещенных веществ и методов ВАДА. Метод вестерн-блоттинга использовался во время чемпионата мира по футболу 2014 года в рамках антидопинговой кампании на этом мероприятии. В общей сложности было собрано и проанализировано более 1000 образцов Reichel et al. в аккредитованной ВАДА лаборатории в Лозанне, Швейцария. Недавние исследования с использованием метода вестерн-блоттинга показали улучшенное обнаружение ЭПО в крови и моче на основе новых сборных горизонтальных гелей Velum SAR, оптимизированных для рутинного анализа. С принятием горизонтального SAR-PAGE в сочетании с готовыми гелями Velum SAR на пленочной основе, избирательная способность микродозного нанесения rEPO была значительно увеличена.
Метод вестерн-блоттинга состоит из гель-электрофореза для разделения нативных белков по 3-D структуре или денатурированных белков по длине полипептида с последующим электрофоретический перенос на мембрану (в основном PVDF или нитроцеллюлоза ) и процедура иммуноокрашивания для визуализации определенного белка на мембране блота. SDS-PAGE обычно используется для денатурирующего электрофоретического разделения белков. SDS обычно используется в качестве буфера (а также в геле), чтобы придать всем присутствующим белкам однородный отрицательный заряд, поскольку белки могут быть заряжены положительно, отрицательно или нейтрально. Этот тип электрофореза известен как SDS-PAGE (электрофорез в SDS-полиакриламидном геле). Перед электрофорезом образцы белков часто кипятят, чтобы денатурировать присутствующие белки. Это гарантирует разделение белков по размеру и предотвращает разложение образцов протеазами (ферментами, расщепляющими белки). После электрофоретического разделения белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлоза или PVDF ), где они блокируются молоком (или другими блокирующими агентами) для предотвращения неспецифического связывания антител. и затем окрашивали антителами, специфичными к целевому белку. Наконец, мембрана будет окрашена вторичным антителом, которое распознает первое окрашивание антителом, которое затем может быть использовано для обнаружения различными методами. Этап гель-электрофореза включен в вестерн-блот-анализ для решения вопроса о перекрестной реактивности антител.
Белки образца разделяют с помощью гель-электрофореза. Разделение белков может производиться по изоэлектрической точке (pI), молекулярной массе, электрическому заряду или комбинации этих факторов. Характер разделения зависит от обработки образца и природы геля.
Безусловно, наиболее распространенный тип гель-электрофореза использует полиакриламидные гели и буферы, загруженные додецилсульфатом натрия (SDS). SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в SDS) поддерживает полипептиды в денатурированном состоянии после их обработки сильными восстанавливающими агентами для удаления вторичной и третичной структуры (например, дисульфидных связей [SS] с сульфгидрильными группами [SH и SH ]) и, таким образом, позволяет разделить белки по их молекулярной массе. Отобранные белки покрываются отрицательно заряженным SDS, фактически становясь анионными, и мигрируют к положительно заряженному (более высокому напряжению) аноду (обычно с красной проволокой) через акриламидную сетку геля. Более мелкие белки быстрее мигрируют через эту сетку, и, таким образом, белки разделяются по размеру (обычно измеряются в килодальтонах, кДа ). Концентрация акриламида определяет разрешение геля - чем больше концентрация акриламида, тем лучше разрешение белков с более низким молекулярным весом. Чем ниже концентрация акриламида, тем лучше разрешение белков с более высокой молекулярной массой. Для большинства блотов белки перемещаются по гелю только в одном измерении.
Образцы загружают в лунки геля. Одна дорожка обычно зарезервирована для маркера или лестницы, которая представляет собой коммерчески доступную смесь белков с известной молекулярной массой, обычно окрашенную так, чтобы образовывать видимые цветные полосы. Когда напряжение прикладывается к гелю, белки перемещаются через него с разной скоростью в зависимости от их размера. Эти разные скорости продвижения (разные электрофоретические подвижности ) разделяются на полосы внутри каждой дорожки. Затем полосы белка можно сравнить с полосами лестничной диаграммы, что позволяет оценить молекулярную массу белка.
Электрофорез в SDS-PAGE Также можно использовать двумерный гель, который распределяет белки из одного образца в двух измерениях. Белки разделяются в соответствии с изоэлектрической точкой (pH, при котором они имеют нейтральный общий заряд) в первом измерении и в соответствии с их молекулярной массой во втором измерении.
Чтобы белки были доступны для обнаружения антител, они перемещаются из геля на мембрану, состоящую из нитроцеллюлозы (NC) или поливинилидендифторида. (ПВДФ). Наиболее часто используемый метод переноса белков называется электроблоттинг. Электроблоттинг использует электрический ток для вытягивания отрицательно заряженных белков из геля к положительно заряженному аноду и в мембрану PVDF или NC. Белки перемещаются изнутри геля на мембрану, сохраняя при этом структуру, которую они имели в геле. Более старый метод переноса включает размещение мембраны поверх геля и стопки фильтровальной бумаги поверх нее. Вся стопка помещается в буферный раствор, который перемещает бумагу за счет капиллярного действия, увлекая за собой белки. На практике этот метод обычно не используется из-за длительного времени процедуры.
В результате любого процесса переноса белки обнажаются на тонком слое мембраны для обнаружения. Обе разновидности мембраны выбраны из-за их неспецифических свойств связывания с белками (т.е. одинаково хорошо связывает все белки). Связывание с белками основано на гидрофобных взаимодействиях, а также на заряженных взаимодействиях между мембраной и белком. Мембраны из нитроцеллюлозы дешевле, чем ПВДФ, но они гораздо более хрупкие и не выдерживают повторных испытаний.
Вестерн-блоттинг Окрашивание общего белка позволяет визуализировать общий белок, который был успешно перенесен на мембрану, что позволяет пользователю проверить однородность переноса белка и выполнить последующая нормализация целевого белка с фактическим количеством белка на дорожку. Нормализация с помощью так называемого «контроля загрузки» была основана на иммуноокрашивании белков домашнего хозяйства по классической процедуре, но в последнее время идет к общему окрашиванию белка из-за множества преимуществ. Для нормализации вестерн-блоттинга описано не менее семи различных подходов к окрашиванию общего белка: Ponceau S, методы без окрашивания, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Амидо Блэк и Cy5. Во избежание шума сигнала перед блокировкой мембраны следует провести окрашивание общего белка. Тем не менее, пост-антитела окрашивания также были описаны.
Поскольку мембрана была выбрана из-за ее способности связывать белок и поскольку и антитела, и мишень являются белками, шаги должны быть приняты для предотвращения взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для обнаружения целевого белка. Блокирование неспецифического связывания достигается путем помещения мембраны в разбавленный раствор белка - обычно 3-5% бычий сывороточный альбумин (BSA) или обезжиренное сухое молоко (оба являются недорогими) в физиологическом растворе с трис-буфером (TBS) или I-Block с небольшим процентным содержанием (0,1%) детергента, такого как Tween 20 или Triton X-100. Хотя обезжиренное сухое молоко является предпочтительным из-за его доступности, необходим соответствующий блокирующий раствор, поскольку не все белки в молоке совместимы со всеми полосами обнаружения. Белок в разбавленном растворе прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепились целевые белки. Таким образом, когда добавляется антитело, оно не может связываться с мембраной, и, следовательно, единственным доступным сайтом связывания является конкретный целевой белок. Это снижает фон в конечном продукте вестерн-блоттинга, что приводит к более четким результатам и исключает ложноположительные результаты.
В процессе обнаружения мембрана «зондируется» на предмет интересующего белка с помощью модифицированного антитела, связанного с репортерным ферментом; при воздействии подходящего субстрата этот фермент запускает колориметрическую реакцию и производит окраску. По ряду причин это обычно происходит в два этапа, хотя теперь для некоторых приложений доступны одноэтапные методы обнаружения.
Первичные антитела образуются, когда вид-хозяин или культура иммунных клеток подвергаются воздействию интересующего белка (или его части). Обычно это часть иммунного ответа, тогда как здесь они собираются и используются в качестве чувствительных и специфических инструментов обнаружения, которые напрямую связывают белок.
После блокирования раствор первичного антитела (обычно от 0,5 до 5 мкг / мл), разведенный в промывочном буфере PBS или TBST, инкубируют с мембраной при осторожном перемешивании в течение обычно часа при комнатной температуре или в течение ночи. при 4 ° С. Раствор антител инкубируют с мембраной в течение от 30 минут до ночи. Его также можно инкубировать при различных температурах, при этом более низкие температуры связаны с большим связыванием, как специфическим (для целевого белка, «сигнал»), так и неспецифическим («шум»). После инкубации мембрану несколько раз промывают промывочным буфером, чтобы удалить несвязанное первичное антитело и тем самым минимизировать фон. Обычно промывочный буферный раствор состоит из забуференного физиологического раствора с небольшим процентным содержанием детергента, а иногда и сухого молока или BSA.
После промывки мембраны для удаления несвязанного первичного антитела мембрана подвергается воздействию другого антитела, известного как вторичное антитело. Антитела происходят из животных источников (или из культур гибридомы животного происхождения). Вторичное антитело распознает видоспецифичную часть первичного антитела и связывается с ней. Следовательно, вторичное антитело против мыши будет связываться практически с любым первичным антителом, полученным от мыши, и может называться «антивидовым» антителом (например, антимышиным, антикозьим и т. Д.). Для обнаружения целевого белка вторичное антитело обычно связывают с биотином или репортерным ферментом, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена <22.>. Это означает, что несколько вторичных антител будут связываться с одним первичным антителом и усиливать сигнал, позволяя обнаруживать белки с гораздо более низкой концентрацией, чем можно было бы увидеть только с помощью SDS-PAGE.
Пероксидаза хрена (HRP) обычно связана со вторичными антителами, что позволяет обнаруживать целевой белок с помощью хемилюминесценции. Хемилюминесцентный субстрат расщепляется HRP, что приводит к образованию люминесценции. Следовательно, производство люминесценции пропорционально количеству вторичного антитела, конъюгированного с HRP, и, следовательно, косвенно измеряет присутствие целевого белка. Чувствительный лист фотопленки прикладывают к мембране, и воздействие света от реакции создает изображение антител, связанных с пятном. Более дешевый, но менее чувствительный подход использует краситель с 1% перекисью водорода ; реакция пероксидных радикалов с 4-хлорнафтолом дает темно-пурпурное пятно, которое можно сфотографировать без использования специальной фотопленки.
Связывание вестерн-блоттингом Как и в процедурах ELISPOT и ELISA, фермент может быть снабжен молекулой субстрата, которая будет преобразована ферментом в окрашенный продукт реакции который будет виден на мембране (см. рисунок ниже с синими полосами).
Другой метод обнаружения вторичных антител использует связанное с флуорофором антитело в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR). Свет, производимый при возбуждении флуоресцентного красителя, является статическим, что делает флуоресцентное обнаружение более точным и точным измерением разницы в сигнале, создаваемом мечеными антителами, связанными с белками, при вестерн-блоттинге. Белки можно точно определить количественно, поскольку сигнал, генерируемый различными количествами белков на мембранах, измеряется в статическом состоянии по сравнению с хемилюминесценцией, при которой свет измеряется в динамическом состоянии.
Третьей альтернативой является использовать радиоактивную метку, а не фермент, связанный со вторичным антителом, например, мечение связывающего антитело белка, такого как Staphylococcus Protein A или Streptavidin, радиоактивным изотопом йода. Поскольку другие методы безопаснее, быстрее и дешевле, этот метод сейчас используется редко; однако преимуществом этого подхода является чувствительность визуализации на основе автоматической радиографии, которая позволяет с высокой точностью определять количество белка в сочетании с оптическим программным обеспечением (например, Optiquant).
Исторически процесс зондирования выполнялся в два этапа из-за относительной легкости получения первичных и вторичных антител в отдельных процессах. Это дает исследователям и корпорациям огромные преимущества с точки зрения гибкости, снижения затрат и добавляет этап усиления к процессу обнаружения. Однако, учитывая появление высокопроизводительного анализа белков и более низких пределов обнаружения, возник интерес к разработке одноэтапных систем зондирования, которые позволили бы процессу происходить быстрее и с меньшим количеством расходных материалов. Для этого требуется зонд-антитело, которое распознает интересующий белок и содержит детектируемую метку, зонды, которые часто доступны для известных белковых тегов. Первичный зонд инкубируется с мембраной таким же образом, как и для первичного антитела в двухэтапном процессе, а затем готов к прямому обнаружению после серии этапов промывки.
Вестерн-блоттинг с использованием системы радиоактивного обнаружения После смывания несвязавшихся зондов вестерн-блоттинг готов к обнаружению зондов, которые помечены и связаны с интересующим белком. С практической точки зрения, не все вестерны обнаруживают белок только в одной полосе мембраны. Приближенные размеры берутся путем сравнения окрашенных полос с полосами маркера или лестницы, загруженных во время электрофореза. Этот процесс обычно повторяется для структурного белка, такого как актин или тубулин, который не должен изменяться между образцами. Количество целевого белка нормализовано к структурному белку для контроля между группами. Превосходной стратегией является нормализация общего белка, визуализированного с помощью трихлорэтанола или эпикокконона. Эта практика обеспечивает корректировку количества общего белка на мембране в случае ошибок или неполных переносов. (см. нормализация вестерн-блоттинга )
Метод колориметрического обнаружения зависит от инкубации вестерн-блоттинга с субстратом, который взаимодействует с ферментом-репортером (таким как пероксидаза ) который связывается со вторичным антителом. Это превращает растворимый краситель в нерастворимую форму другого цвета, которая осаждается рядом с ферментом и тем самым окрашивает мембрану.Затем развитие блота останавливается смыванием растворимого красителя. Уровни белка оценивается с помощью денситометрии (насколько интенсивно окрашивание) или спектрофотометрии.
Хемилюминесцентные методы обнаружения зависят от инкубации вестерн-блоттинга с субстратом, который будет люминесцировать при экспонировании к репортеру на вторичном антителе. Затем свет обнаруживается камерами CCD, которые фиксируют цифровое изображение вестерн-блоттинга или фотографической пленки. Использование пленки для обнаружения вестерн-блоттинга постепенно исчезает из-за отсутствия n линейность изображения (неточная количественная оценка). Изображение анализируется с помощью денситометрии, которая оценивает относительное количество окрашивания белка и количественно оценивает результаты с точки зрения оптической плотности. Новое программное обеспечение позволяет проводить дальнейший анализ данных, например анализ молекулярной массы, если используются соответствующие стандарты.
Вестерн-блот-хемилюминесцентное обнаружение Для радиоактивных меток не требуются ферментные субстраты, но они позволяют размещать медицинскую рентгеновскую пленку непосредственно против вестерн-блоттинга, который проявляется по мере воздействия к этикетке и создает темные области, которые соответствуют интересующим полосам белка (см. изображение выше). Важность методов обнаружения радиоактивных веществ снижается из-за их опасного излучения, поскольку они очень дороги, риски для здоровья и безопасности высоки, а ECL (усиленная хемилюминесценция) является полезной альтернативой.
Зонд с флуоресцентной меткой возбуждается светом, а затем излучение возбуждения обнаруживается фотодатчиком, например камерой CCD, оснащенной соответствующими фильтрами излучения, который захватывает цифровое изображение вестерн-блоттинг и позволяет проводить дальнейший анализ данных, такой как анализ молекулярной массы и количественный вестерн-блоттинг. Флуоресценция считается одним из лучших методов количественной оценки, но она менее чувствительна, чем хемилюминесценция.
Одно из основных различий между нитроцеллюлозными и PVDF-мембранами заключается в способности каждого из них поддерживать " удаление антител и повторное использование мембраны для последующих проб антител. Несмотря на то, что существуют хорошо зарекомендовавшие себя протоколы очистки нитроцеллюлозных мембран, более прочный ПВДФ позволяет упростить очистку и использовать повторно, прежде чем фоновый шум ограничит эксперименты. Еще одно отличие состоит в том, что, в отличие от нитроцеллюлозы, ПВДФ перед использованием необходимо замочить в 95% этаноле, изопропаноле или метаноле. Мембраны из ПВДФ также имеют тенденцию быть более толстыми и более устойчивыми к повреждениям во время использования. Гелевый электрофорез в 2-D мугилане
В двумерном SDS-PAGE используются принципы и методы, изложенные выше. 2-D SDS-PAGE, как следует из названия, включает миграцию полипептидов в двух измерениях. Например, в первом измерении полипептиды разделяются в соответствии с изоэлектрической точкой, тогда как во втором измерении полипептиды разделяются в соответствии с их молекулярной массой. Изоэлектрическая точка данного белка определяется относительным количеством положительно (например, лизин, аргинин) и отрицательно (например, глутамат, аспартат) заряженных аминокислот, при этом отрицательно заряженные аминокислоты вносят вклад в низкую изоэлектрическую точку, а положительно заряженные аминокислоты вносят свой вклад. до высокой изоэлектрической точки. Образцы также можно разделить сначала в невосстанавливающих условиях с помощью SDS-PAGE и в восстанавливающих условиях во втором измерении, которое разрывает дисульфидные связи, удерживающие субъединицы вместе. SDS-PAGE можно также сочетать с мочевиной-PAGE для получения 2-мерного геля.
В принципе, этот метод позволяет разделить все клеточные белки на одном большом геле. Основным преимуществом этого метода является то, что он часто различает разные изоформы конкретного белка, например белок, который был фосфорилирован (добавлением отрицательно заряженной группы). Разделенные белки можно вырезать из геля и затем проанализировать с помощью масс-спектрометрии, которая определяет их молекулярную массу.
Биологический портал 
Технологический портал 
Химический портал 