Войти
В биохимии, биотинилирование - это процесс ковалентного присоединения биотина к белку, нуклеиновой кислоте или другой молекуле. Биотинилирование происходит быстро, специфично и вряд ли нарушит естественную функцию молекулы из-за небольшого размера биотина (молекулярная масса = 244,31 г / моль). Биотин связывается с стрептавидином и авидином с чрезвычайно высокой аффинностью, быстрой скоростью и высокой специфичностью, и эти взаимодействия используются во многих областях биотехнологии для выделения представляющих интерес биотинилированных молекул. Связывание биотина со стрептавидином и авидином устойчиво к экстремальным температурам, pH и протеолизу, что делает возможным захват биотинилированных молекул в самых разных средах. Кроме того, несколько молекул биотина могут быть конъюгированы с представляющим интерес белком, что позволяет связывать несколько стрептавидина, авидина или белковые молекулы нейтравидина и повышают чувствительность обнаружения интересующего белка. Существует большое количество доступных реагентов для биотинилирования, которые используют широкий спектр возможных методов мечения. Из-за сильного сродства между биотином и стрептавидином очистка биотинилированных белков была широко используемым подходом для идентификации белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных событий, таких как убиквитилирование в молекулярной биологии.
Белки могут быть биотинилированы химически или ферментативно. В химическом биотинилировании используются различные химические процессы конъюгирования для получения неспецифического биотинилирования аминов, карбоксилатов, сульфгидрилов и углеводов (например, NHS-сочетание приводит к биотинилированию любых первичных аминов в белке). Ферментативное биотинилирование приводит к биотинилированию определенного лизина в определенной последовательности бактериальной биотинлигазой. Большинство реагентов химического биотинилирования состоят из реакционноспособной группы, присоединенной через линкер к боковой цепи валериановой кислоты биотина. Поскольку биотин-связывающий карман в авидине / стрептавидине скрыт под поверхностью белка, желательны реагенты для биотинилирования, обладающие более длинным линкером, поскольку они позволяют молекуле биотина, когда она прикреплена к своей мишени, быть более доступной для связывания авидина / стрептавидина. / Белок нейтравидин. Этот линкер может также опосредовать растворимость реагентов биотинилирования; линкеры, которые включают поли (этилен) гликоль (PEG), могут сделать нерастворимые в воде реагенты растворимыми или повысить растворимость реагентов биотинилирования, которые уже растворимы до некоторой степени.
В отличие от методов химического биотинилирования, ферментативное биотинилирование позволяет биотину связываться точно по одному остатку, присутствующему в белке. Эта реакция биотинилирования также может идти до завершения, что означает, что продукт генерируется с высокой однородностью и может быть связан с стрептавидином в определенной ориентации, например для мультимеров MHC. Ферментативное биотинилирование чаще всего осуществляется путем слияния интересующего белка на его N-конце, C-конце или во внутренней петле с пептидом из 15 аминокислот, называемым AviTag или акцепторным пептидом (AP). Этот тег служит сайтом узнавания биотин-холофермент-синтетазы E. coli, также известной как биотинлигаза (BirA). После метки белок затем инкубируют с BirA, позволяя биотинилированию происходить в присутствии биотина и АТФ. Ферментативное биотинилирование можно проводить in vitro, но BirA также специфично реагирует со своим целевым пептидом внутри клеток млекопитающих и бактерий и на поверхности клетки, тогда как другие клеточные белки не модифицируются. Ферментативное биотинилирование также может происходить in vivo, обычно за счет совместной экспрессии белка, меченного Avitag, и BirA. Другой способ биотинилирования белков - это слияние целевого белка с белком-носителем карбоксила биотина (BCCP). Белок, слитый BCCP, может распознаваться молекулами биотина in vivo и присоединяться к нему.
Наиболее распространенными мишенями для модификации молекул протеина являются первичные амины. группы, которые присутствуют в виде боковой цепи лизина и N-концевых α-аминов. Реагенты для биотинилирования, реагирующие с амином, можно разделить на две группы на основании растворимости в воде.
Сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS) имеют плохую растворимость в водных растворах. Для реакций в водном растворе их сначала необходимо растворить в органическом растворителе, затем разбавить водной реакционной смесью. Наиболее часто используемые органические растворители для этой цели - это диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), которые совместимы с большинством белков при низких концентрациях. Из-за гидрофобности NHS-эфиров реагенты для биотинилирования NHS также могут диффундировать через клеточную мембрану, что означает, что они будут биотинилировать как внутренние, так и внешние компоненты клетки .
Сульфо-NHS сложные эфиры являются более растворимы в воде и должны быть растворены в воде непосредственно перед использованием, поскольку они легко гидролизуются. Растворимость в воде сульфо-NHS-сложных эфиров проистекает из их сульфонатной группы на N-гидроксисукцинимидном кольце и устраняет необходимость растворения реагента в органическом растворителе. Сульфо-NHS-эфиры биотина также могут быть использованы в качестве реагентов для биотинилирования клеточной поверхности, поскольку они не проникают через клеточную мембрану.
Химические реакции эфиров NHS- и сульфо-NHS практически идентичны в том смысле, что они оба самопроизвольно реагирует с аминами с образованием амидной связи. Поскольку мишенью для сложного эфира является депротонированный первичный амин, реакция протекает в основных условиях (pH выше 7). Гидролиз сложного эфира NHS является основной конкурирующей реакцией, и скорость гидролиза увеличивается с увеличением pH. NHS- и сульфо-NHS-эфиры имеют период полураспада нескольких часов при pH 7, но всего несколько минут при pH 9.
Условия для конъюгирования NHS обладают некоторой гибкостью. -эфиры первичных аминов. Температура инкубации может составлять от 4 до 37 ° C, значения pH в диапазоне реакции от 7 до 9, а время инкубации колеблется от нескольких минут до 12 часов. Следует избегать использования буферов, содержащих амины (такие как Трис или глицин ), поскольку они конкурируют с реакцией.
Альтернативой биотинилированию первичного амина является мечение сульфгидрильных групп биотином. Поскольку свободные сульфгидрильные группы менее распространены в большинстве белков по сравнению с первичными аминами, сульфгидрильное биотинилирование полезно, когда первичные амины расположены в регуляторном домене (ах) целевого белка или когда требуется пониженный уровень биотинилирования.. Сульфгидрильные группы, такие как малеимиды, галогенацетилы и пиридилдисульфиды, требуют свободных сульфгидрильных групп для конъюгирования; сначала необходимо восстановить дисульфидные связи, чтобы освободить сульфгидрильные группы для биотинилирования. Если свободные сульфгидрильные группы недоступны, лизины можно модифицировать с помощью различных реагентов тиолирования (реагент Траута, SAT (PEG4), SATA и SATP), что приводит к добавлению свободного сульфгидрила.. Сульфгидрилбиотинилирование проводят при немного более низком pH (6,5-7,5), чем мечение эфирами NHS.
Помимо цельных белков, биотинилированные пептиды могут быть синтезированы путем введения остатка цистеина (Cys) во время синтеза на конце аминокислотной цепи, чтобы получить сайт-специфическое и ориентированное биотинилирование. Нуклеотиды также могут быть биотинилированы путем включения биотинилированных нуклеотидов.
Карбоксильные группы находятся на С-концевых концах белков и на боковых цепях глутамата и аспартата аминокислот. Реагенты для биотинилирования, которые нацелены на карбоксильные группы, не имеют карбоксил-реактивного фрагмента как такового, а вместо этого полагаются на сшивающий агент карбодиимид, такой как EDC, для связывания первичного амина на реагентах биотинилирования с карбоксилом группа на целевой белок.
Биотинилирование карбоксильных групп происходит при pH 4,5–5,5. Чтобы предотвратить перекрестную реакцию сшивающего агента с компонентами буфера, буферы не должны содержать первичных аминов (например, Трис, глицин ) или карбоксилов (например, ацетат, цитрат ); Буфер MES - идеальный выбор.
Гликопротеины можно биотинилировать, модифицируя углеводные остатки до альдегидов, которые затем реагируют с гидразином - или реагенты для биотинилирования на основе алкоксиамина. Периодат натрия окисляет сиаловые кислоты на гликопротеинах до альдегидов с образованием этих стабильных связей при pH 4–6.
Поликлональные антитела сильно гликозилированы, и поскольку гликозилирование не влияет на активность антител, биотинилирование гликозильных групп является идеальной стратегией для создания биотинилированных антител.
Олигонуклеотиды легко биотинилируются в ходе синтеза олигонуклеотидов фосфорамидитным методом с использованием коммерческого биотинфосфорамидита. После стандартного снятия защиты полученные конъюгаты могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой или анионообменной ВЭЖХ
Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования идеальны, когда первичные амины, сульфгидрилы, карбоксилы и углеводы не доступны для маркировки. Эти реагенты зависят от арилазидов, которые активируются ультрафиолетовым светом (УФ;>350 нм), которые затем вступают в реакцию по связям C-H и N-H. Поскольку эти типы связей возникают независимо от типа аминокислоты, этот тип биотинилирования называют «неспецифическим».
Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования также можно использовать для активации биотинилирования в определенные моменты времени в эксперименте или в определенных условиях реакции, просто подвергая реакцию УФ-свету в определенное время или в определенных условиях.
Тег биотина можно использовать в аффинной хроматографии вместе с колонкой, содержащей авидин (или стрептавидин или нейтравидин ), связанный с ним, который является естественным лигандом для биотина. Однако для разрыва взаимодействия авидин / стрептавидин-биотин необходимы жесткие условия (например, 6M GuHCl при pH 1,5), что, скорее всего, денатурирует белок, несущий биотиновую метку. Если требуется выделение помеченного белка, лучше пометить белок. Этот аналог биотина дает прочное связывание с авидином / стрептавидином при щелочном pH, но сродство снижается при понижении pH. Следовательно, функциональный белок, меченный иминобиотином, может быть высвобожден из колонки авидин / стрептавидин путем снижения pH (примерно до pH 4).
Этот тег также можно использовать для обнаружения белок через антибиотин антитела или стратегии обнаружения, меченные авидином / стрептавидином, такие как ферментные репортеры (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза ) или флуоресцентные зонды. Это может быть полезно для локализации с помощью флуоресцентной или электронной микроскопии, анализов ELISA, анализов ELISPOT, вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. Обнаружение с помощью моновалентного стрептавидина позволяет избежать кластеризации или агрегации биотинилированной мишени.
нековалентная связь, образованная между биотином и авидином или стрептавидином, имеет аффинность связывания это выше, чем у большинства связей антигена и антитела, и приближается к прочности ковалентной связи. Это очень прочное связывание делает маркировку белков биотином полезным инструментом для таких приложений, как аффинная хроматография с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина для отделения биотинилированного белка от смеси других белков и биохимических веществ. Биотинилированный белок, такой как биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА), используется в твердофазных анализах в качестве покрытия на поверхности лунок в многолуночных аналитических планшетах. Биотинилирование красных кровяных телец использовалось как средство определения общего объема крови без использования радиоактивных меток, таких как хром 51, что позволяет определять объем у младенцев с низкой массой тела при рождении и беременных женщин, которые иначе не могли бы подвергнуться воздействию требуемые дозы радиоактивности. Кроме того, биотинилирование молекул МНС для создания мультимеров МНС стало полезным инструментом для идентификации и выделения популяций антиген-специфичных Т-клеток. Совсем недавно было разработано биотинилирование белков in vivo для изучения белок-белковых взаимодействий и близости в живых клетках
Условия реакции для биотинилирования выбираются таким образом молекула-мишень (например, антитело) помечена молекулами биотина, достаточными для очистки или обнаружения молекулы, но не настолько, чтобы биотин мешал функции молекулы.
Анализ HABA (2- (4-гидроксиазобензол) бензойная кислота) можно использовать для определения степени биотинилирования. Краситель HABA связан с авидином или стрептавидином и дает характерное поглощение. Когда вводятся биотинилированные белки или другие молекулы, биотин вытесняет краситель, что приводит к изменению оптической плотности при 500 нм. Это изменение прямо пропорционально уровню биотина в образце. Недостатком анализа HABA является то, что он использует большое количество образца.
Степень биотинилирования также можно измерить с помощью сдвига геля стрептавидина, поскольку стрептавидин остается связанным с биотином во время электрофореза в агарозном геле или полиакриламида гель-электрофорез. Долю биотинилированной мишени можно измерить по изменению интенсивности полосы мишени с избытком стрептавидина или без него, что можно быстро и количественно увидеть для биотинилированных белков по окрашиванию кумасси бриллиантовым синим.
