Войти
Цифровое изображение 3 плазмидных рестрикционных гидролизатов, проведенных на 1% масс. / Об. Агарозном геле, 3 вольт / см, окрашенном этидием бромид. Маркер размера ДНК представляет собой коммерческую лестницу размером 1 т.п.н. Отмечается положение лунок и направление миграции ДНК. Электрофорез в агарозном геле - это метод гель-электрофореза, используемый в биохимии, молекулярной биологии, генетика и клиническая химия для разделения смешанной популяции макромолекул, таких как ДНК или белки, в матрице агарозы, одного из двух основных компонентов из агара. Белки могут быть разделены по заряду и / или размеру (изоэлектрический фокус электрофорез в агарозе по существу не зависит от размера), а фрагменты ДНК и РНК - по длине. Биомолекулы разделяются посредством приложения электрического поля для перемещения заряженных молекул через матрицу агарозы, и биомолекулы разделяются по размеру в матрице геля агарозы.
Гель агарозы легко отливать, имеет относительно меньше заряженных групп и особенно подходит для разделения ДНК в диапазоне размеров, наиболее часто встречающемся в лабораториях, что объясняет популярность его использования. Отделенную ДНК можно рассматривать с помощью красителя, чаще всего в УФ-свете, и фрагменты ДНК можно относительно легко экстрагировать из геля. Большинство используемых гелей агарозы растворены на 0,7–2% в подходящем буфере для электрофореза.
Гель агарозы, отлитый в лотке, для использования в гель-электрофорезе Гель агарозы представляет собой трехкомпонентный размерная матрица, образованная спиральными молекулами агарозы в суперспиральных пучках, которые агрегированы в трехмерные структуры с каналами и порами, через которые могут проходить биомолекулы. Трехмерная структура удерживается вместе водородными связями и поэтому может быть разрушена путем нагревания до жидкого состояния. Температура плавления отличается от температуры гелеобразования, в зависимости от источников агарозный гель имеет температуру гелеобразования 35–42 ° C и температуру плавления 85–95 ° C. Также доступны агарозы с низкой температурой плавления и с низким содержанием геля, полученные путем химических модификаций.
Гель агарозы имеет большой размер пор и хорошую прочность геля, что делает его пригодным в качестве антиконвекционной среды для электрофореза ДНК и больших молекул белка. Размер пор 1% геля оценивается от 100 нм до 200–500 нм, а его прочность геля позволяет гелям с разбавлением до 0,15% образовывать пластину для гель-электрофореза. Однако гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие, и поэтому с ними трудно обращаться. Гель агарозы имеет меньшую разрешающую способность, чем гель полиакриламида, для ДНК, но имеет больший диапазон разделения, и поэтому используется для фрагментов ДНК размером обычно 50–20 000 п.н. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 т.п.н., но разрешение более 6 МБ возможно при гель-электрофорезе в импульсном поле (PFGE). Его также можно использовать для разделения крупных белков, и он является предпочтительной матрицей для гель-электрофореза частиц с эффективными радиусами более 5-10 нм. 0,9% -ный агарозный гель имеет поры, достаточно большие для проникновения бактериофага Т4.
. Полимер агарозы содержит заряженные группы, в частности пируват и сульфат. Эти отрицательно заряженные группы создают поток воды в направлении, противоположном движению ДНК, в процессе, называемом электроэндосмосом (ЭЭО), и поэтому могут замедлять движение ДНК и вызывать размытие полос. Гели с более высокой концентрацией будут иметь более высокий электроэндосмотический поток. Поэтому агароза с низким EEO обычно предпочтительна для использования в агарозном геле-электрофорезе нуклеиновых кислот, но агароза с высоким EEO может использоваться для других целей. Более низкое содержание сульфата в агарозе с низким EEO, особенно в агарозе с низкой температурой плавления (LMP), также полезно в тех случаях, когда ДНК, выделенная из геля, должна использоваться для дальнейших манипуляций, поскольку присутствие загрязняющих сульфатов может повлиять на некоторые последующие процедуры, такие как как лигирование и ПЦР. Однако агарозы с нулевым ЭЭО нежелательны для некоторых применений, поскольку они могут быть получены путем добавления положительно заряженных групп, и такие группы могут влиять на последующие ферментативные реакции. Электроэндосмос является причиной использования агарозы вместо агара, поскольку компонент агаропектина в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина в агарозе существенно снижает EEO, а также снижает неспецифическую адсорбцию биомолекул на гелевой матрице. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез белков сыворотки, может быть желательным высокий EEO, и в используемый гель может быть добавлен агаропектин.
Гели препаратов плазмид обычно показывают большую полосу суперспиральной ДНК с другими более слабыми полосами на той же полосе. Обратите внимание, что обычно гель ДНК отображается с меньшими фрагментами ДНК ближе ко дну геля. Это связано с тем, что исторически гели ДНК запускались вертикально, а меньшие фрагменты ДНК перемещались вниз быстрее. На миграцию нуклеиновых кислот может влиять ряд факторов: размер пор геля (концентрация геля), размер ДНК, подвергаемой электрофорезу, используемое напряжение, ионная сила буфера и концентрация интеркалирующего красителя, такого как бромид этидия, если он используется во время электрофореза.
Меньшие молекулы перемещаются быстрее, чем большие молекулы в геле, а двухцепочечная ДНК движется со скоростью скорость, которая обратно пропорциональна логарифму количества пар оснований. Однако эта взаимосвязь нарушается с очень большими фрагментами ДНК, и разделение очень крупных фрагментов ДНК требует использования гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE), который применяет переменный ток с двух разных направлений, и большие фрагменты ДНК подвергаются разделяются по мере их переориентации с изменяющимся током.
Для стандартного электрофореза в агарозном геле более крупные молекулы лучше разделяются при использовании геля с низкой концентрацией, тогда как молекулы меньшего размера лучше разделяются в геле с высокой концентрацией. Однако гель с высокой концентрацией требует более длительного времени работы (иногда дней).
На движение ДНК может влиять конформация молекулы ДНК, например, сверхспиральная ДНК обычно движется быстрее, чем расслабленная ДНК, потому что она плотно свернута. а значит, более компактный. В препарате нормальной плазмидной ДНК может присутствовать несколько форм ДНК. Гель-электрофорез плазмид обычно показывает отрицательно свернутую форму в качестве основной полосы, в то время как разорванная ДНК (открытая круглая форма) и расслабленная закрытая круговая форма проявляются как второстепенные полосы. Однако скорость, с которой перемещаются различные формы, может изменяться при использовании различных условий электрофореза, и на подвижность более крупной кольцевой ДНК может сильнее влиять размер пор геля, чем на линейную ДНК.
Бромид этидия, который интеркалирует в кольцевая ДНК может изменять заряд, длину, а также суперсильность молекулы ДНК, поэтому ее присутствие в геле во время электрофореза может влиять на ее движение. Например, положительный заряд бромистого этидия может уменьшить движение ДНК на 15%. Электрофорез в агарозном геле можно использовать для разделения кольцевой ДНК с различной топологией суперспирализации.
Повреждение ДНК из-за повышенного перекрестного сшивания также снижает электрофоретическую миграцию ДНК в зависимости от дозы.
Скорость миграции ДНК пропорциональна приложенному напряжению, т.е. чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Однако разрешение больших фрагментов ДНК ниже при высоком напряжении. Подвижность ДНК также может изменяться в нестабильном поле - в поле, которое периодически меняется, подвижность ДНК определенного размера может значительно снижаться при определенной частоте циклов. Это явление может привести к инверсии полосы при гель-электрофорезе с инверсией поля (FIGE), в результате чего более крупные фрагменты ДНК перемещаются быстрее, чем более мелкие.
Отрицательный заряд ее фосфата каркас перемещает ДНК к положительно заряженному аноду во время электрофореза. Однако миграция молекул ДНК в растворе в отсутствие гелевой матрицы не зависит от молекулярной массы во время электрофореза. Таким образом, гелевая матрица отвечает за разделение ДНК по размеру во время электрофореза, и существует ряд моделей, объясняющих механизм разделения биомолекул в гелевой матрице. Широко распространена модель Огстона, в которой полимерная матрица рассматривается как сито. Глобулярный белок или случайный клубок ДНК движется через соединенные между собой поры, и движение более крупных молекул с большей вероятностью будет затруднено и замедлено из-за столкновений с гелевой матрицей, и поэтому молекулы разных размеров могут быть разделенными в этом процессе просеивания.
Однако модель Огстона не работает для больших молекул, в результате чего поры значительно меньше размера молекулы. Для молекул ДНК размером более 1 т.п.н. чаще всего используется модель рептации (или ее варианты). Эта модель предполагает, что ДНК может ползать «змеиным» образом (отсюда и «рептация») через поры в виде удлиненной молекулы. Модель смещения рептаций применяется при более высокой напряженности электрического поля, когда ведущий конец молекулы сильно смещается в прямом направлении и тянет за собой остальную часть молекулы. Однако флуоресцентная микроскопия окрашенных молекул в реальном времени показала более тонкую динамику во время электрофореза, при этом ДНК демонстрирует значительную эластичность, поскольку она попеременно растягивается в направлении приложенного поля, а затем сжимается в шар или зацепляется в U-образную форму. когда он зацепляется за полимерные волокна.
Детали эксперимента с электрофорезом в агарозном геле могут варьироваться в зависимости от методов, но большинство из них следует общей процедуре.
Воспроизвести медиа Видео, демонстрирующее сборку оборудования и загрузку / прогон геля. 
Загрузка образцов ДНК в лунки агарозного геля с помощью многоканальной пипетки. Гель готовят путем растворения порошка агарозы в подходящем буфере, таком как ТАЕ или ТВЕ, для использования в электрофорезе. Агарозу диспергируют в буфере перед нагреванием до температуры, близкой к температуре кипения, но избегайте кипения. Расплавленной агарозе дают остыть в достаточной степени, прежде чем заливать раствор в гипс, так как он может деформироваться или треснуть, если раствор агарозы слишком горячий. В гипс помещается гребешок для создания лунок для загрузки образца, и гель должен полностью затвердеть перед использованием.
Концентрация геля влияет на разрешение разделения ДНК. Гель агарозы состоит из микроскопических пор, через которые проходят молекулы, и существует обратная зависимость между размером пор геля агарозы и его концентрацией - размер пор уменьшается по мере увеличения плотности волокон агарозы. Высокая концентрация геля улучшает разделение более мелких молекул ДНК, а снижение концентрации геля позволяет разделять большие молекулы ДНК. Этот процесс позволяет разделить фрагменты от 50 пар оснований до нескольких мега оснований в зависимости от используемой концентрации геля. Концентрация измеряется в соотношении веса агарозы к объему использованного буфера (г / мл). Для стандартного электрофореза в агарозном геле 0,8% гель дает хорошее разделение или разрешение больших фрагментов ДНК размером 5–10 килобайт, а 2% гель дает хорошее разрешение для небольших фрагментов размером 0,2–1 килобайт. Для стандартного электрофореза часто используют 1% гели. Гели с высоким процентным содержанием часто бывают хрупкими и не могут схватываться равномерно, в то время как гели с низким процентным содержанием (0,1-0,2%) хрупки и с ними нелегко обращаться. Гели агарозы с низкой температурой плавления (LMP) также более хрупкие, чем гель нормальной агарозы. Агароза с низкой температурой плавления может использоваться отдельно или одновременно со стандартной агарозой для разделения и выделения ДНК. PFGE и FIGE часто выполняются с использованием гелей с высоким содержанием агарозы.
После затвердевания геля гребенку удаляют, оставляя лунки, в которые можно загрузить образцы ДНК. Буфер для загрузки смешивают с образцом ДНК перед загрузкой смеси в лунки. Загрузочный буфер содержит плотное соединение, которым может быть глицерин, сахароза или фиколл, которое увеличивает плотность образца, так что образец ДНК может опуститься на дно лунки. Если после приготовления образец ДНК содержит остаточный этанол, он может выплыть из лунки. Загрузочный буфер также включает окрашенные красители, такие как ксилолцианол и бромфеноловый синий, используемые для отслеживания хода электрофореза. Образцы ДНК загружают с помощью пипетки.
пластинки агарозного геля в резервуаре для электрофореза с полосами красителей, указывающими на ход электрофореза. ДНК движется к аноду. Электрофорез в агарозном геле чаще всего проводят горизонтально в подводном режиме, при котором пластинчатый гель полностью погружается в буфер во время электрофореза. Также возможно, но реже, проводить электрофорез как в вертикальном, так и в горизонтальном положении с гелем, приподнятым на ножках агарозы, с использованием соответствующего устройства. Буфер, используемый в геле, такой же, как рабочий буфер в резервуаре для электрофореза, поэтому электрофорез в подводном режиме возможен с гелем агарозы.
Для оптимального разрешения ДНК размером более 2 т.п.н. при стандартном гель-электрофорезе рекомендуется от 5 до 8 В / см (расстояние в см относится к расстоянию между электродами, поэтому это рекомендуемое напряжение будет от 5 до 8 В / см). 8 умножить на расстояние между электродами в см). Напряжение также может быть ограничено тем фактом, что он нагревает гель и может вызвать плавление геля, если он работает под высоким напряжением в течение длительного периода, особенно если используемый гель представляет собой гель агарозы LMP. Слишком высокое напряжение может также снизить разрешение, а также вызвать появление полос для больших молекул ДНК. Слишком низкое напряжение может привести к расширению полосы для небольших фрагментов ДНК из-за дисперсии и диффузии.
Поскольку ДНК не видна в естественном свете, за ходом электрофореза следят с помощью цветных красителей. Ксилолцианол (светло-голубой цвет) объединяет большие фрагменты ДНК, в то время как бромфеноловый синий (темно-синий) объединяется с более мелкими фрагментами. Менее распространенные красители включают крезоловый красный и оранжевый G, которые мигрируют впереди бромфенолового синего. Маркер ДНК также используется для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК. Однако следует отметить, что размер кольцевой ДНК-подобной плазмиды нельзя точно измерить с помощью стандартных маркеров, если он не был линеаризован с помощью рестрикционного расщепления, в качестве альтернативы можно использовать маркер суперспиральной ДНК.
Гель с УФ-освещением: ДНК, окрашенная бромидом этидия, проявляется в виде светящихся оранжевых полос. ДНК и РНК обычно визуализируются при окрашивании бромид этидия, который внедряется в основные бороздки ДНК и флуоресцирует в УФ-свете. Интеркаляция зависит от концентрации ДНК, и, таким образом, полоса с высокой интенсивностью будет указывать на большее количество ДНК по сравнению с полосой с меньшей интенсивностью. Бромид этидия может быть добавлен к раствору агарозы до образования геля, или гель ДНК может быть окрашен позже после электрофореза. Обесцвечивание геля не обязательно, но может улучшить изображение. Доступны другие методы окрашивания; примерами являются SYBR Green, GelRed, метиленовый синий, бриллиантовый крезиловый синий, нильский синий сульфат и кристально-фиолетовый. SYBR Green, GelRed и другие аналогичные коммерческие продукты продаются как более безопасные альтернативы бромиду этидия, поскольку он мутагенный в тесте Эймса, хотя канцерогенность бромистого этидия фактически не установлено. SYBR Green требует использования трансиллюминатора синего света. ДНК, окрашенную кристаллическим фиолетовым, можно рассматривать при естественном освещении без использования УФ-трансиллюминатора, что является преимуществом, однако он может не давать четкой полосы.
При окрашивании бромистым этидием гель просматривают с помощью ультрафиолетового (УФ) трансиллюминатора. УФ-свет возбуждает электроны в ароматическом кольце бромистого этидия, и как только они возвращаются в основное состояние, высвобождается свет, заставляя ДНК и комплекс бромида этидия флуоресцировать. Стандартные трансиллюминаторы используют длины волн 302/312 нм (УФ-В), однако воздействие УФ-излучения на ДНК в течение всего 45 секунд может вызвать повреждение ДНК и повлиять на последующие процедуры, например, снижение эффективности трансформации, in vitro транскрипция и ПЦР. Следовательно, следует ограничить воздействие УФ-излучения на ДНК. Использование более высокой длины волны 365 нм (диапазон УФ-А) вызывает меньшее повреждение ДНК, но также дает гораздо более слабую флуоресценцию с бромидом этидия. Если в трансиллюминторе можно выбрать несколько длин волн, более короткая длина волны будет использоваться для захвата изображений, тогда как более длинная длина волны должна использоваться, если необходимо работать с гелем в течение любого длительного периода времени.
Трансиллюминатор может также содержать устройства захвата изображения, такие как цифровая или поляроидная камера, которые позволяют снимать или печатать изображение геля.
Для гель-электрофореза белка полосы могут быть визуализированы с помощью Кумасси или серебряных пятен.
Вырезание срезов геля агарозы. При использовании УФ-трансиллюминатора необходимо носить защитное снаряжение. Разделенные полосы ДНК часто используются для дальнейших процедур, а полосу ДНК можно вырезать из геля в виде среза, растворить и очистить. Однако загрязняющие вещества могут влиять на некоторые последующие процедуры, такие как ПЦР, и в некоторых случаях может быть предпочтительна агароза с низкой температурой плавления, поскольку она содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции. Гели также можно использовать для блоттинга.
В целом идеальный буфер должен иметь хорошую проводимость, выделять меньше тепла и иметь долгий срок службы. Для электрофореза в агарозе используется ряд буферов; общие для нуклеиновых кислот включают трис / ацетат / EDTA (TAE) и трис / борат / EDTA (TBE). Используемые буферы содержат ЭДТА для инактивации многих нуклеаз, для функционирования которых требуется двухвалентный катион. Борат в буфере TBE может быть проблематичным, поскольку борат может полимеризоваться и / или взаимодействовать с цис-диолами, такими как те, которые содержатся в РНК. TAE имеет самую низкую буферную емкость, но обеспечивает лучшее разрешение для ДНК большего размера. Это означает более низкое напряжение и больше времени, но более качественный продукт.
Было предложено много других буферов, например борат лития (LB), изоэлектрический гистидин, буферы для согласованных продуктов pK и т.д.; в большинстве случаев предполагаемое объяснение - более низкий ток (меньше тепла) и / или согласованная подвижность ионов, что приводит к увеличению срока службы буфера. Трис-фосфатный буфер обладает высокой буферной способностью, но его нельзя использовать, если экстрагированная ДНК будет использоваться в реакции, чувствительной к фосфату. LB является относительно новым и неэффективен при разрешении фрагментов размером более 5 кб; Однако из-за его низкой проводимости можно использовать гораздо более высокое напряжение (до 35 В / см), что означает более короткое время анализа для обычного электрофореза. Разница в размере всего одной пары оснований может быть устранена в 3% -ном агарозном геле со средой с чрезвычайно низкой проводимостью (1 мМ борат лития).
В особых случаях может использоваться другая буферная система, например, барбитуровая кислота -барбитурат натрия или трис- барбитурат буферы могут использоваться для электрофореза белков в агарозном геле, например, при обнаружении аномального распределения белков.
Гели агарозы легко отливать и обрабатывать по сравнению с другими матрицами, а нуклеиновые кислоты не изменяются химически во время электрофореза. Образцы также легко восстанавливаются. После окончания эксперимента полученный гель можно хранить в полиэтиленовом пакете в холодильнике.
Электрофорез проводится в буферных растворах для уменьшения изменений pH из-за электрического поля, что важно, потому что заряд ДНК и РНК зависит от pH, но слишком долгая работа может истощить буферную способность раствора. Кроме того, разные препараты генетического материала могут не мигрировать согласованно друг с другом по морфологическим или другим причинам.
