Войти
A липкий конец лигирование В молекулярной биологии, лигирование представляет собой соединение двух фрагментов нуклеиновой кислоты под действием фермента. Это важная лабораторная процедура молекулярного клонирования ДНК, при которой фрагменты ДНК объединяются для создания молекул рекомбинантной ДНК, например, когда фрагмент чужеродной ДНК вставляется в плазмида. Концы фрагментов ДНК соединяются путем образования фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксилом одного конца ДНК с 5'-фосфорилом другого. РНК также может быть лигирована аналогичным образом. В реакции обычно участвует кофактор, обычно это АТФ или НАД.
Лигирование в лаборатории обычно выполняется с использованием T4 ДНК-лигазы, однако также популярны процедуры лигирования без использования стандартной ДНК-лигазы.
Механизм реакции лигирования был впервые выяснен в лаборатории Роберта Лемана. Два фрагмента ДНК могут быть соединены вместе с помощью ДНК-лигазы, которая катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3'-OH на одном конце цепи ДНК и 5'-фосфатной группой другого. У животных и бактериофага в качестве источника энергии для лигирования используется АТФ, а у бактерий NAD.
ДНК. лигаза сначала реагирует с АТФ или НАД, образуя промежуточное соединение лигаза-АМФ с АМФ, связанным с ε-аминогруппой лизина в активном центре лигазы через фосфоамидную связь. Эта аденилильная группа затем переносится на фосфатную группу на 5'-конце цепи ДНК, образуя комплекс ДНК-аденилат. Наконец, фосфодиэфирная связь между двумя концами ДНК образуется в результате нуклеофильной атаки 3'-гидроксила на конце одной цепи ДНК на активированную 5'-фосфорильную группу другой.
A ник в ДНК (т.е. разрыв в одной цепи двухцепочечной ДНК) может быть очень эффективно восстановлен лигазой. Однако при лигировании двух отдельных концов ДНК возникает усложняющая особенность лигирования, поскольку эти два конца должны соединиться, прежде чем реакция лигирования может продолжиться. При лигировании ДНК с липкими или когезивными концами выступающие нити ДНК могут быть уже отожжены вместе, поэтому это относительно эффективный процесс, поскольку он эквивалентен восстановлению двух разрывов в ДНК. Однако при лигировании тупых концов, у которых отсутствуют выступающие концы для ДНК для отжига вместе, процесс зависит от случайного столкновения концов для совмещения, прежде чем они могут быть лигированы, и, следовательно, гораздо менее эффективный процесс. ДНК-лигаза из E. coli не может лигировать ДНК с тупым концом, кроме как в условиях молекулярного скопления, и поэтому обычно не используется для лигирования в лаборатории. Вместо этого используется ДНК-лигаза из фага T4, поскольку она может лигировать ДНК с тупыми концами, а также одноцепочечную ДНК.
Факторы, влияющие на Ферментно-опосредованная химическая реакция, естественно, будет влиять на реакцию лигирования, например, на концентрацию фермента и реагентов, а также на температуру реакции и продолжительность инкубации. Лигирование осложняется тем фактом, что желаемые продукты лигирования для большинства реакций лигирования должны находиться между двумя разными молекулами ДНК, а реакция включает как меж-, так и внутримолекулярные реакции, и что для эффективного лигирования необходима дополнительная стадия отжига.
Три этапа образования новой фосфодиэфирной связи во время лигирования: аденилилирование фермента, перенос аденилила на ДНК и запечатывание разрывов. Mg (2+) является кофактором для катализа, поэтому при высокой концентрации Mg (2+) эффективность лигирования высока. Если концентрация Mg (2+) ограничена, образование разрывов является лимитирующей реакцией процесса, и промежуточное соединение аденилилированной ДНК остается в растворе. Такое аденилилирование фермента сдерживает повторное связывание с аденилилированной промежуточной ДНК, сравниваемой с ахиллесовой пятой LIG1, и представляет риск, если они не зафиксированы.
Концентрация ДНК может повлиять на скорость лигирования и на то, является ли лигирование межмолекулярной или внутримолекулярной реакцией. Лигирование включает соединение концов ДНК с другими концами, однако каждый фрагмент ДНК имеет два конца, и если концы совместимы, молекула ДНК может образовывать кольцевую форму, соединив свои собственные концы. При высокой концентрации ДНК существует большая вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с концом другой ДНК, тем самым образуя межмолекулярное лигирование. При более низкой концентрации ДНК вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с другим концом той же молекулы, увеличивается, поэтому более вероятна внутримолекулярная реакция, приводящая к циркуляризации ДНК. Эффективность трансформации линейной ДНК также намного ниже, чем кольцевой ДНК, и для циркуляризации ДНК концентрация ДНК не должна быть слишком высокой. Как правило, общая концентрация ДНК должна быть менее 10 мкг / мл.
Относительная концентрация фрагментов ДНК, их длина, а также условия буфера также являются факторами, которые могут влиять на межмолекулярный или внутримолекулярный реакции приветствуются.
Концентрация ДНК может быть искусственно увеличена путем добавления конденсирующих агентов, таких как гексамин кобальта и биогенных полиаминов, таких как спермидин, или с помощью агенты скучивания, такие как полиэтиленгликоль (PEG), которые также увеличивают эффективную концентрацию ферментов. Однако обратите внимание, что добавки, такие как гексамин кобальта, могут вызывать исключительно межмолекулярную реакцию, приводящую к линейным конкатемерам, а не кольцевой ДНК, более подходящим для трансформации плазмидной ДНК, и поэтому они нежелательны для лигирования плазмид.. Если необходимо использовать добавки при лигировании плазмиды, предпочтительно использование ПЭГ, поскольку он может способствовать внутримолекулярному, а также межмолекулярному лигированию.
Чем выше концентрация лигазы, тем быстрее скорость перевязки. Лигирование тупых концов намного менее эффективно, чем лигирование липких концов, поэтому при лигировании тупых концов используется более высокая концентрация лигазы. Высокая концентрация ДНК-лигазы может использоваться в сочетании с ПЭГ для более быстрого лигирования, и они являются компонентами, часто встречающимися в коммерческих наборах, разработанных для быстрого лигирования.
При рассмотрении возникают два вопроса. температура реакции лигирования. Во-первых, оптимальная температура для активности ДНК-лигазы, которая составляет 37 ° C, и, во-вторых, температура плавления (Tm) концов ДНК, подлежащих лигированию. Температура плавления зависит от длины и состава оснований выступа ДНК - чем больше количество G и C, тем выше T m, поскольку между парой оснований GC образованы три водородные связи по сравнению с двумя для Пара оснований AT - с некоторым вкладом от наложения оснований между фрагментами. Чтобы реакция лигирования протекала эффективно, концы должны быть стабильно отожжены, а в экспериментах по лигированию T m концов ДНК обычно намного ниже 37 ° C. Таким образом, оптимальная температура для лигирования липких концов является компромиссом между наилучшей температурой для активности ДНК-лигазы и T m, где концы могут связываться. Однако разные рестрикционные ферменты генерируют разные концы, и основной состав концов, производимых этими ферментами, также может отличаться, температура плавления и, следовательно, оптимальная температура может широко варьироваться в зависимости от используемых рестрикционных ферментов, а оптимальная температура для лигирования может быть между 4-15C в зависимости от концов. Лигирование также часто включает лигирование концов, полученных от разных рестрикционных ферментов в одной и той же реакционной смеси, поэтому выбор оптимальной температуры для конкретной реакции лигирования может оказаться непрактичным, и в большинстве протоколов просто выбирают 12-16 ° C, комнатную температуру или 4 ° C.
Ионная сила используемого буфера может повлиять на лигирование. Типы присутствия катионов также могут влиять на реакцию лигирования, например, избыточное количество Na может сделать ДНК более жесткой и увеличить вероятность межмолекулярного лигирования. При высокой концентрации одновалентного катиона (>200 мМ) лигирование также может быть почти полностью подавлено. Стандартный буфер, используемый для лигирования, разработан для минимизации ионных эффектов.
Ферменты рестрикции могут генерировать самые разные концы в ДНК, которую они переваривают, но в экспериментах по клонированию чаще всего -используемые рестрикционные ферменты создают одноцепочечный выступ из 4 оснований, называемый липким или когезионным концом (исключения включают NdeI, который генерирует выступ из 2 оснований, и те, которые образуют тупые концы). Эти липкие концы могут отжигаться с другими совместимыми концами и лигироваться в результате лигирования липких концов (или когезионных концов). EcoRI, например, генерирует конец AATT, и поскольку A и T имеют более низкую температуру плавления, чем C и G, его температура плавления T m низкая и составляет около 6 ° C. Для большинства рестрикционных ферментов полученные выступы имеют T m, которая составляет около 15 ° C. Для практических целей лигирование липких концов проводят при 12-16 ° C или при комнатной температуре, или, альтернативно, при 4 ° C в течение более длительного периода.
Для вставки фрагмента ДНК в плазмидный вектор предпочтительно использовать два разных рестрикционных фермента для расщепления ДНК, чтобы образовались разные концы. Два разных конца могут предотвратить повторное соединение вектора без какой-либо вставки, а также позволяют вставлять фрагмент направленным образом.
Когда невозможно использовать два разных сайта, может потребоваться дефосфорилирование векторной ДНК, чтобы избежать высокого фона рециркуляризованной векторной ДНК без вставки. Без фосфатной группы на концах вектор не может лигироваться сам с собой, но может быть лигирован со вставкой с фосфатной группой. Дефосфорилирование обычно выполняется с помощью щелочной фосфатазы из кишечника теленка (CIAP), которая удаляет фосфатную группу с 5'-конца расщепленной ДНК, но обратите внимание, что CIAP нелегко инактивировать и может мешать лигированию без дополнительных шаг по удалению CIAP, что приводит к невозможности лигирования. CIAP не следует использовать в чрезмерных количествах, и его следует использовать только при необходимости. Креветки щелочная фосфатаза (SAP) или антарктическая фосфатаза (AP) являются подходящей альтернативой, поскольку их можно легко инактивировать.
Лигирование тупого конца не предполагает спаривания оснований выступающих концов, поэтому любой тупой конец можно лигировать с другим тупым концом. Тупые концы могут быть образованы рестрикционными ферментами, такими как и EcoRV. Основным преимуществом клонирования тупых концов является то, что желаемая вставка не требует каких-либо сайтов рестрикции в своей последовательности, поскольку тупые концы обычно генерируются в ПЦР, а ПЦР генерируют тупые Затем фрагмент ДНК с концами можно лигировать в вектор с тупыми концами, полученный из рестрикционного гидролизата.
Лигирование тупого конца, однако, намного менее эффективно, чем лигирование липкого конца, обычно реакция в 100 раз медленнее, чем лигирование липкого конца. Поскольку тупой конец не имеет выступающих концов, реакция лигирования зависит от случайных столкновений между тупыми концами и, следовательно, намного менее эффективна. Чтобы компенсировать более низкую эффективность, концентрация используемой лигазы выше, чем при лигировании липких концов (в 10 раз или больше). Концентрация ДНК, используемая при лигировании тупых концов, также выше, чтобы увеличить вероятность столкновения между концами, и более длительное время инкубации также может использоваться для лигирования тупых концов.
Если оба конца, которые необходимо лигировать в вектор, имеют тупой конец, то вектор необходимо дефосфорилировать, чтобы минимизировать самолигирование. Это можно сделать с помощью CIAP, но, как отмечалось ранее, при его использовании необходимо соблюдать осторожность. Поскольку вектор был дефосфорилирован, а для лигирования требуется присутствие 5'-фосфата, вставка должна быть фосфорилирована. В продукте ПЦР с тупыми концами обычно отсутствует 5'-фосфат, поэтому его необходимо фосфорилировать обработкой полинуклеотидкиназой Т4..
Лигирование тупых концов также обратимо ингибируется высокой концентрацией АТФ.
ПЦР обычно генерирует продукты ПЦР с тупым концом, но обратите внимание, что ПЦР с использованием Taq-полимеразы может добавить дополнительный аденин (A) к 3'-концу продукта ПЦР. Это свойство можно использовать в клонировании ТА, где концы продукта ПЦР могут отжигаться с концом T вектора. ТА-лигирование, следовательно, представляет собой форму лигирования липких концов. Векторы с тупыми концами можно превратить в вектор для лигирования ТА с дидезокситимидинтрифосфатом (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы.
Для клонирования вставки в кольцевую плазмиду:
Иногда лигирование не дает желаемых лигированных продуктов, и некоторые Возможными причинами могут быть:
В ряде имеющихся в продаже наборов для клонирования ДНК используются другие методы лигирования, которые не требуют использования обычных ДНК-лигаз. Эти методы позволяют выполнять клонирование намного быстрее, а также упрощают перенос вставки клонированной ДНК в различные векторы. Однако эти методы требуют использования специально разработанных векторов и компонентов и могут не иметь гибкости.
Топоизомераза может использоваться вместо лигазы для лигирования, и клонирование может быть выполнено более быстро без необходимости рестрикционного переваривания вектора или вставки. В этом методе клонирования TOPO линеаризованный вектор активируется путем присоединения топоизомеразы I к его концам, и этот «TOPO-активированный» вектор может затем принимать продукт ПЦР путем лигирования с обоими 5'-концами ПЦР. продукта, топоизомераза высвобождается, и при этом образуется кольцевой вектор.
Другой метод клонирования без использования лигазы - рекомбинация ДНК, например, как используется в системе клонирования шлюза. Ген, однажды клонированный в клонирующий вектор (называемый в этом методе входным клоном), может быть удобно введен в различные экспрессионные векторы путем рекомбинации.
