Войти
Ограничение дайджеста является процедурой, используемой в области молекулярной биологии, чтобы подготовить ДНК для анализа или другой обработки. Иногда это называют фрагментацией ДНК (этот термин также используется для других процедур). Хартл и Джонс описывают это так:
Этот ферментативный метод можно использовать для расщепления молекул ДНК в определенных сайтах, гарантируя, что все фрагменты ДНК, содержащие определенную последовательность в определенном месте, имеют одинаковый размер; кроме того, каждый фрагмент, содержащий желаемую последовательность, имеет последовательность, расположенную точно в том же положении внутри фрагмента. В методе расщепления используется важный класс ДНК-расщепляющих ферментов, выделенных в основном из бактерий. Эти ферменты называются рестрикционными эндонуклеазами или рестрикционными ферментами, и они способны расщеплять молекулы ДНК в положениях, в которых присутствуют определенные короткие последовательности оснований.
Полученная расщепленная ДНК очень часто избирательно амплифицируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), что делает ее более подходящей для аналитических методов, таких как электрофорез в агарозном геле и хроматография. Он используется в генетическом снятии отпечатков пальцев, субклонировании плазмид и анализе RFLP.
Данный фермент рестрикции разрезает сегменты ДНК в пределах определенной нуклеотидной последовательности, в том, что называется сайтом рестрикции. Эти последовательности распознавания обычно имеют длину четыре, шесть, восемь, десять или двенадцать нуклеотидов и обычно имеют палиндромную форму (т.е. одинаковую нуклеотидную последовательность в направлении 5 '- 3'). Поскольку существует очень много способов упорядочить четыре нуклеотида, из которых состоит ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), в последовательность из четырех-двенадцати нуклеотидов, последовательности распознавания обычно возникают случайно в любой длинной последовательности. Ферменты рестрикции, специфичные для сотен различных последовательностей, были идентифицированы и синтезированы для продажи лабораториям, и в результате несколько потенциальных «сайтов рестрикции» появляются почти в любом гене или интересующем локусе на любой хромосоме. Кроме того, почти все искусственные плазмиды включают (часто полностью синтетический) полилинкер (также называемый «сайтом множественного клонирования»), который содержит десятки последовательностей распознавания рестрикционных ферментов в очень коротком сегменте ДНК. Это позволяет вставлять практически любой конкретный фрагмент ДНК в плазмидные векторы, которые можно эффективно «клонировать» путем вставки в реплицирующиеся бактериальные клетки.
После рестрикционного переваривания ДНК можно анализировать с помощью электрофореза в агарозном геле. При гель-электрофорезе образец ДНК сначала «загружают» на пластину агарозного геля (буквально пипеткой вносят в маленькие лунки на одном конце пластины). Затем гель подвергается воздействию электрического поля, которое протягивает через него отрицательно заряженную ДНК. Молекулы перемещаются с разной скоростью (и, следовательно, оказываются на разных расстояниях) в зависимости от их чистого заряда (более заряженные частицы перемещаются дальше) и размера (более мелкие частицы перемещаются дальше). Поскольку ни одно из четырех нуклеотидных оснований не несет заряда, чистый заряд становится незначительным, и размер является основным фактором, влияющим на скорость диффузии через гель. Чистый заряд в ДНК производится сахарно-фосфатным остовом. Это отличается от белков, в которых нет «основы», а чистый заряд генерируется различными комбинациями и количеством заряженных аминокислот.
Рестрикционный гидролизат чаще всего используется как часть процесса молекулярного клонирования фрагмента ДНК в вектор (такой как вектор клонирования или вектор экспрессии ). Вектор обычно содержит сайт множественного клонирования, где можно найти множество сайтов рестрикции, и чужеродный фрагмент ДНК может быть вставлен в вектор, сначала разрезав сайты рестрикции в векторе, а также фрагмент ДНК, с последующим лигированием фрагмента ДНК. в вектор.
Ограничительные дайджесты также необходимы для выполнения любого из следующих аналитических методов:
Существует множество типов рестрикционных ферментов, каждый из которых по-своему разрезает ДНК. Наиболее часто используемые рестрикционные ферменты - это рестрикционные эндонуклеазы II типа ( примеры см. В статье о рестрикционных ферментах ). Некоторые из них разрезают последовательность из трех пар оснований, в то время как другие могут разрезать четыре, шесть и даже восемь. Каждый фермент обладает различными свойствами, которые определяют, насколько эффективно он может разрезать и при каких условиях. Большинство производителей, производящих такие ферменты, часто предоставляют специальный буферный раствор, который содержит уникальную смесь катионов и других компонентов, которые помогают ферменту в разрезании с максимальной эффективностью. Различные рестрикционные ферменты также могут иметь разные оптимальные температуры, при которых они функционируют.
Обратите внимание, что для эффективного переваривания ДНК сайт рестрикции не должен располагаться в самом конце фрагмента ДНК. Ферментам рестрикции может потребоваться минимальное количество пар оснований между сайтом рестрикции и концом ДНК, чтобы фермент работал эффективно. Это количество может варьироваться между ферментами, но для наиболее часто используемых рестрикционных ферментов достаточно около 6-10 пар оснований.
