Войти
Агарозный гель в лотке, используемый для гель-электрофореза Агароза представляет собой полисахарид, обычно экстрагируемый из некоего красных водорослей. Это линейный полимер, состоящий из повторяющейся единицы агаробиозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из D-галактозы и 3,6-ангидро- L - галактопираноза. Агароза является одним из двух основных компонентов агара и очищается от агара путем удаления другого компонента агара, агаропектин.
Агароза часто используется в молекулярной биологии для разделение больших молекул, особенно ДНК, с помощью электрофореза. Пластинки агарозных гелей (обычно 0,7–2%) для электрофореза легко приготовить путем заливки теплого жидкого раствора в форму. Для этой цели коммерчески доступен широкий спектр различных агароз с разной молекулярной массой и свойствами. Агароза также может быть сформирована в шарики и использоваться в ряде хроматографических методов очистки белка.
Структура повторяющейся единицы полимера агарозы. Агароза представляет собой линейный полимер с молекулярной массой около 120 000, состоящий из чередующихся D-галактозы и 3,6 -ангидро- L -галактопираноза, связанная α- (1 → 3) и β- (1 → 4) гликозидными связями. 3,6-ангидро- L -галактопираноза представляет собой L -галактозу с ангидромостом между 3 и 6 положениями, хотя некоторые звенья L -галактозы в полимере может не содержаться мостик. Некоторые звенья D -галактозы и L -галактозы могут быть метилированы, также обнаружены пируват и сульфат в небольших количествах.
Каждая цепочка агарозы содержит ~ 800 молекул галактозы, а полимерные цепи агарозы образуют спиральные волокна, которые объединяются в сверхспиральную структуру с радиусом 20-30 нм. Волокна квазижесткие и имеют широкий диапазон длины в зависимости от концентрации агарозы. После затвердевания волокна образуют трехмерную сетку каналов с диаметром в диапазоне от 50 нм до>200 нм в зависимости от концентрации используемой агарозы - более высокие концентрации дают более низкий средний диаметр пор. Трехмерная структура удерживается вместе с помощью водородных связей и поэтому может быть разрушена путем нагревания до жидкого состояния.
Агароза доступна в виде белого порошка, который растворяется в воде, близкой к кипению, и образует гель при охлаждении. Агароза проявляет явление термического гистерезиса при переходе от жидкости к гелю, то есть гелеобразование и плавление при разных температурах. Температура гелеобразования и плавления варьируется в зависимости от типа агарозы. Стандартные агарозы, полученные из гелидия, имеют температуру гелеобразования 34–38 ° C (93–100 ° F) и температуру плавления 90–95 ° C (194–203 ° F), а агарозы, полученные из Gracilaria из-за его более высоких метокси заместителей имеет температуру гелеобразования 40–52 ° C (104–126 ° F) и температуру плавления 85–90 ° C (185– 194 ° F). Температура плавления и гелеобразования может зависеть от концентрации геля, особенно при низкой концентрации геля менее 1%. Поэтому температуры гелеобразования и плавления даны для определенной концентрации агарозы.
Природная агароза содержит незаряженные метильные группы, и степень метилирования прямо пропорциональна температуре гелеобразования. Однако синтетическое метилирование имеет обратный эффект, в результате чего повышенное метилирование снижает температуру гелеобразования. Различные химически модифицированные агарозы с различными температурами плавления и гелеобразования доступны посредством химических модификаций.
Агароза в геле образует сетку, которая содержит поры, и размер пор зависит от концентрации добавленной агарозы. При стоянии агарозные гели склонны к синерезису (вытеснению воды через поверхность геля), но этот процесс идет достаточно медленно, чтобы не мешать использованию геля.
Агарозный гель. может иметь высокую прочность геля при низкой концентрации, что делает его пригодным в качестве антиконвекционной среды для гель-электрофореза. Гели агарозы, разбавленные до 0,15%, могут образовывать пластины для гель-электрофореза. Полимер агарозы содержит заряженные группы, в частности пируват и сульфат. Эти отрицательно заряженные группы могут замедлять движение молекул ДНК в процессе, называемом электроэндосмосом (EEO), поэтому агароза с низким EEO обычно предпочтительна для использования в электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозном геле. Также доступны агарозы с нулевым EEO, но они могут быть нежелательными для некоторых применений, поскольку они могут быть получены путем добавления положительно заряженных групп, которые могут повлиять на последующие ферментативные реакции. Электроэндосмос является причиной предпочтительного использования агарозы перед агаром, поскольку агаропектин в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина в агарозе существенно снижает EEO, а также снижает неспецифическую адсорбцию биомолекул на гелевой матрице. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез сывороточного белка, может быть желательным высокий EEO, и в используемый гель можно добавить агаропектин.
Плавление и температуры гелеобразования агарозы могут быть изменены химическими модификациями, чаще всего гидроксиэтилированием, которое уменьшает количество внутрицепочечных водородных связей, что приводит к более низким температурам плавления и схватывания, чем у стандартных агароз. Точная температура определяется степенью замещения, и многие доступные агарозы с низкой температурой плавления (LMP) могут оставаться жидкими при диапазоне 30–35 ° C (86–95 ° F). Это свойство позволяет проводить ферментативные манипуляции непосредственно после гель-электрофореза ДНК путем добавления срезов расплавленного геля, содержащего интересующий фрагмент ДНК, в реакционную смесь. Агароза LMP содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции, и поэтому ее предпочтительно использовать для некоторых приложений. Гидроксиэтилирование может уменьшить размер пор за счет уменьшения плотности упаковки агарозных пучков, поэтому гель LMP также может влиять на время и разделение во время электрофореза. Агарозы со сверхнизкой температурой плавления или гелеобразования могут образовывать гель только при 8–15 ° C (46–59 ° F).
Агарозный гель с полосами ДНК, окрашенными бромидом этидия и визуализированными в УФ-свете на УФ-трансиллюминаторе. Агароза является предпочтительной матрицей для работы с белки и нуклеиновые кислоты, поскольку он обладает широким диапазоном физической, химической и термической стабильности, а его более низкая степень химической сложности также снижает вероятность его взаимодействия с биомолекулами. Агароза чаще всего используется в качестве среды для электрофоретического разделения в аналитических масштабах при электрофорезе в агарозном геле . Гели, изготовленные из очищенной агарозы, имеют относительно большой размер пор, что делает их полезными для разделения больших молекул, таких как белки и белковые комплексы>200 килодальтон, а также фрагменты ДНК>100 пар оснований. Агароза также широко используется для ряда других применений, например для иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, поскольку агарозные волокна функционируют как якорь для иммунокомплексов.
Электрофорез в агарозном геле является обычным методом разделения ДНК в лаборатории. Гели агарозы имеют более низкую разрешающую способность для ДНК, чем гели акриламида, но они имеют больший диапазон разделения и поэтому обычно используются для фрагментов ДНК длиной 50–20 000 п.н. (пар оснований ), хотя разрешение более 6 МБ возможно с гель-электрофорезом в импульсном поле (PFGE). Его также можно использовать для разделения крупных белковых молекул, и он является предпочтительной матрицей для гель-электрофореза частиц с эффективным радиусом более 5-10 нм.
Размер пор гель влияет на размер просеиваемой ДНК. Чем ниже концентрация геля, тем больше размер пор и тем больше ДНК, которую можно просеять. Однако гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие и поэтому с ними трудно обращаться, а электрофорез больших молекул ДНК может занять несколько дней. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 т.п.н. Этот предел может быть преодолен с помощью PFGE, когда к гелю прикладываются переменные ортогональные электрические поля. Фрагменты ДНК переориентируются при изменении направления приложенного поля, но более крупным молекулам ДНК требуется больше времени, чтобы перестроиться при изменении электрического поля, а для более мелких - быстрее, и поэтому ДНК можно фракционировать по размеру.
Гели агарозы отливают в форму и, когда они застывают, обычно проходят горизонтально, погруженные в буферный раствор. Трис-ацетат-ЭДТА и трис-борат-ЭДТА буферы обычно используются, но другие буферы, такие как трис-фосфат, барбитуровая кислота-барбитурат натрия или трис- барбитурат буферы могут использоваться в других приложениях. ДНК обычно визуализируется окрашиванием бромидом этидия, а затем просматривается в УФ-свете, но доступны и другие методы окрашивания, такие как SYBR Green, GelRed, метиленовый синий и кристаллический фиолетовый. Если разделенные фрагменты ДНК необходимы для дальнейшего последующего эксперимента, их можно вырезать из геля на кусочки для дальнейших манипуляций.
Гель-фильтрационные колонки на основе агарозы, используемые для очистки белка на аппарате AKTA FPLC. Матрица из агарозного геля часто используется для очистки белка, например, при препаративном разделении на колонке, как в гель-фильтрационной хроматографии, аффинной хроматографии и ионообменной хроматографии. Однако он не используется в виде непрерывного геля, а скорее формируется в виде пористых шариков или смол различной степени измельчения. Гранулы очень пористые, поэтому белок может свободно проходить через гранулы. Эти шарики на основе агарозы, как правило, мягкие и легко измельчаются, поэтому их следует использовать в условиях гравитационного потока, низкоскоростного центрифугирования или при низком давлении. Прочность смол можно повысить за счет увеличения сшивки и химического отверждения смол агарозы, однако такие изменения могут также привести к более низкой связывающей способности для белка в некоторых процедурах разделения, таких как аффинная хроматография.
Агароза полезный материал для хроматографии, поскольку он не абсорбирует биомолекулы в какой-либо значительной степени, имеет хорошие свойства текучести и может выдерживать экстремальные значения pH и ионной силы, а также высокую концентрацию денатурирующие вещества, такие как 8M мочевина или 6M гуанидин HCl. Примерами матрицы на основе агарозы для гель-фильтрационной хроматографии являются Сефароза и WorkBeads 40 SEC (поперечно-сшитая агароза с гранулами), Praesto и Супероза (сшитые гранулы агарозы с высокой степенью сшивки) и Superdex. (декстран, ковалентно связанный с агарозой).
Для аффинной хроматографии гранулированная агароза является наиболее часто используемой матричной смолой для присоединения лигандов, связывающих белок. Лиганды ковалентно связаны через спейсер с активированными гидроксильными группами полимера в виде гранул агарозы. Затем представляющие интерес белки могут быть избирательно связаны с лигандами, чтобы отделить их от других белков, после чего их можно элюировать. Используемые гранулы агарозы обычно имеют плотность 4% и 6% с высокой способностью связывания белка.
Иногда вместо агара можно использовать чашку с агарозой для культивирования организмов, поскольку агар может содержать примеси, которые могут повлиять на рост организма или некоторые последующие процедуры, такие как полимераза цепная реакция (ПЦР). Агароза также тверже, чем агар, и поэтому может быть предпочтительнее там, где необходима более высокая прочность геля, а ее более низкая температура гелеобразования может предотвратить причинение теплового шока организма, когда клетки суспендированы в жидкости перед гелеобразованием. Его можно использовать для культивирования строго автотрофных бактерий, растений протопластов, Caenorhabditis elegans, других организмов и различных клеточных линий.
Агароза часто используется в качестве основы для трехмерной культуры клеток человека и животных . Поскольку агароза образует нецитотоксические гидрогели, ее можно использовать для воспроизведения естественной среды клеток в организме человека, внеклеточного матрикса. Однако агароза образует жесткий инертный гидрогель, который не несет никакой биологической информации, поэтому клетки человека и животных не могут прикрепляться к полисахариду. Из-за этих специфических свойств агароза гидрогель имитирует естественную среду хрящевых клеток и, как было показано, поддерживает дифференцировку хондроцитов в хрящ. Чтобы изменить механические свойства агарозы для воспроизведения естественной среды других человеческих клеток, агароза может быть химически модифицирована путем точного окисления первичного спирта D- галактозы в карбоновая кислота. Эта химическая модификация обеспечивает новый класс материалов, называемых карбоксилированной агарозой. Посредством контроля количества карбоксилированной D-галактозы на основной цепи полисахарида можно точно контролировать механические свойства получаемого гидрогеля. Эти карбоксилированные гидрогели агарозы затем могут быть ковалентно связаны с пептидами с образованием гидрогеля, на котором клетки могут прилипать. Было показано, что эти гидрогели карбоксилированной агарозы направляют организацию эндотелиальных клеток человека в поляризованные просветы. Смешивание полностью карбоксилированной агарозы с природной агарозой может быть использовано для получения гидрогелей с широким диапазоном механических свойств.
Иногда вместо агара для измерения подвижности и подвижности микроорганизмов используют агарозу.. Подвижные виды смогут, хотя и медленно, мигрировать через пористый гель, и тогда можно будет визуализировать скорость инфильтрации. Пористость геля напрямую связана с концентрацией агара или агарозы в среде, поэтому гели с различной концентрацией могут использоваться для оценки плавания, роения, скольжения и подергивание моторики. Анализ миграции клеток под агарозой можно использовать для измерения хемотаксиса и хемокинеза. Слой агарозного геля помещают между популяцией клеток и хемоаттрактантом . Поскольку градиент концентрации развивается из диффузии хемоаттрактанта в гель, различные популяции клеток, требующие различных уровней стимуляции для миграции, затем могут быть визуализированы с течением времени с помощью микрофотографии, поскольку они туннелируют вверх через гель против силы тяжести вдоль градиента..
