Эксклюзивная хроматография

редактировать
Эксклюзивная хроматография
Исключение размера.jpg Оборудование для проведения эксклюзионной хроматографии. Буфер прокачивается через колонку (справа) управляемым компьютером устройством
АкронимSEC
КлассификацияХроматография
Аналитымакромолекулы. синтетические полимеры. биомолекулы
ПроизводителиCytiva, Bio-Works, Bio-Rad, Knauer, emp Biotech
Другие методы
СопутствующиеВысокоэффективная жидкостная хроматография. Водная нормальная фаза хроматография. ионообменная хроматография. мицеллярная жидкостная хроматография

эксклюзионная хроматография (SEC ), также известная как хроматография на молекулярных ситах, представляет собой хроматографический метод, в котором молекулы в растворе разделяются по их размеру и в некоторых случаях молекулярной массе. Обычно его применяют к большим молекулам или макромолекулярным комплексам, таким как белки и промышленные полимеры. Обычно, когда для транспортировки образца через колонку используется водный раствор, метод известен как гель-фильтрационная хроматография, в отличие от названия гель-проникающей хроматографии, которое используется, когда в качестве подвижной фазы используется органический растворитель. Хроматографическая колонка заполнена мелкими пористыми шариками, которые состоят из полимеров декстрана (Сефадекс), агарозы (Сефароза) или полиакриламида (Сефакрил или Биогель П). Размеры пор этих шариков используются для оценки размеров макромолекул. SEC является широко используемым методом характеристики полимера из-за его способности обеспечивать хорошие результаты молярно-массового распределения (Mw) для полимеров.

Содержание

  • 1 Применение
  • 2 Преимущества
  • 3 Открытие
  • 4 Теория и метод
  • 5 Факторы, влияющие на фильтрацию
  • 6 Анализ
  • 7 Приложения
    • 7.1 Биохимические приложения
    • 7.2 Синтез полимера
  • 8 Недостаток
  • 9 Абсолютная эксклюзионная хроматография
  • 10 См. Также
  • 11 Ссылки
  • 12 Внешние ссылки

Приложения

Основное применение гель-фильтрационная хроматография - это фракционирование белков и других водорастворимых полимеров, тогда как гель-проникающая хроматография используется для анализа молекулярно-массового распределения органических растворимых полимеров. Ни один из этих методов не следует путать с гель-электрофорезом, где электрическое поле используется для «вытягивания» или «проталкивания» молекул через гель в зависимости от их электрических зарядов. Время, в течение которого растворенное вещество остается в поре, зависит от размера поры. Более крупные растворенные вещества будут иметь доступ к меньшему объему и наоборот. Следовательно, растворенное вещество меньшего размера будет оставаться в поре в течение более длительного периода времени по сравнению с более крупным растворенным веществом.

Еще одно применение эксклюзионной хроматографии - это исследование стабильности и характеристик природного органического вещества в воде. В этом методе Маргит Б. Мюллер, Даниэль Шмитт и Фриц Х. Фриммель проверили источники воды из разных уголков мира, чтобы определить, насколько стабильно природное органическое вещество в течение определенного периода времени. Несмотря на то, что эксклюзионная хроматография широко используется для изучения природного органического материала, существуют ограничения. Одно из этих ограничений включает отсутствие стандартного маркера молекулярной массы; таким образом, сравнивать результаты не с чем. Если требуется точный молекулярный вес, следует использовать другие методы.

Преимущества

Преимущества этого метода включают хорошее отделение больших молекул от маленьких молекул с минимальным объемом элюата, а также возможность применения различных растворов, не мешая процессу фильтрации, все при сохранении биологической активности частиц отделяться. Этот метод обычно сочетается с другими, которые дополнительно разделяют молекулы по другим характеристикам, таким как кислотность, основность, заряд и сродство к определенным соединениям. При эксклюзионной хроматографии существует короткое и четко определенное время разделения и узкие полосы, что обеспечивает хорошую чувствительность. Также отсутствует потеря образца, поскольку растворенные вещества не взаимодействуют с неподвижной фазой.

Другим преимуществом этого экспериментального метода является то, что в некоторых случаях возможно определить приблизительную молекулярную массу соединения. Форма и размер соединения (элюент) определяют, как соединение взаимодействует с гелем (неподвижная фаза). Для определения приблизительной молекулярной массы получают объемы элюирования соединений с их соответствующими молекулярными массами, а затем строят график зависимости «K av » от «log (Mw)», где K av = (В е - В о) / (В т - В о) {\ displaystyle K_ {av} = (V_ {e} -V_ {o}) / (V_ {t} -V_ {o})}{\ displaystyle K_ {av} = (V_ {e} -V_ {o}) / (V_ {t} -V_ {o})} и Mw - молекулярная масса. Этот график действует как калибровочная кривая, которая используется для приблизительного определения молекулярной массы желаемого соединения. Компонент V e представляет собой объем, при котором элюируются промежуточные молекулы, такие как молекулы, которые имеют частичный доступ к шарикам колонки. Кроме того, V t представляет собой сумму общего объема между гранулами и объема внутри гранул. Компонент V o представляет собой объем, при котором элюируются более крупные молекулы, которые элюируются вначале. Недостатки заключаются, например, в том, что можно разместить только ограниченное количество полос, потому что шкала времени хроматограммы мала, и, как правило, для хорошего разрешения должна быть разница в 10% молекулярной массы.

Discovery

Этот метод был изобретен в 1955 году Грантом Генри Лате и Колином Ратвеном, работавшими в больнице королевы Шарлотты в Лондоне. Позже они получили за это изобретение Премию Джона Скотта. В то время как Лэтэ и Рутвен использовали гели крахмала в качестве матрицы, Джеркер Порат и позже представили гели декстрана; другие гели со свойствами фракционирования по размеру включают агарозу и полиакриламид. Появился краткий обзор этих разработок.

Были также попытки фракционировать синтетические высокополимеры; однако, только в 1964 году Дж. К. Мур из Dow Chemical Company опубликовал свою работу по созданию гель-проникающей хроматографии (ГПХ) колонок на основе сшитых полистирол с контролируемым размером пор, что положило начало быстрому росту исследовательской деятельности в этой области. Практически сразу было установлено, что при надлежащей калибровке GPC может предоставить информацию о молярной массе и молярном массовом распределении для синтетических полимеров. Поскольку последнюю информацию было трудно получить другими методами, ГПХ быстро стал широко использоваться.

Теория и метод

SEC-колонки на основе агарозы, используемые для очистки белков на AKTA FPLC машина.

SEC используется в первую очередь для анализа больших молекул, таких как белки или полимеры. SEC работает, улавливая более мелкие молекулы в порах адсорбента («неподвижная фаза»). Этот процесс обычно выполняется в колонне, которая обычно состоит из полой трубки, плотно набитой полимерными шариками микронного размера, содержащими поры разного размера. Эти поры могут быть углублениями на поверхности или каналами в валике. По мере того как раствор движется по колонке, некоторые частицы попадают в поры. Более крупные частицы не могут проникнуть в такое количество пор. Чем крупнее частицы, тем быстрее элюирование. Более крупные молекулы просто проходят через поры, потому что эти молекулы слишком велики, чтобы попасть в поры. Следовательно, молекулы большего размера проходят через колонку быстрее, чем молекулы меньшего размера, то есть чем меньше молекула, тем больше время удерживания.

Одним из требований к SEC является то, что аналит не взаимодействует с поверхностью неподвижных фаз, при этом различия во времени элюирования между аналитами, в идеале, основываются исключительно на объеме растворенного вещества, в которое аналиты могут войти, а не химическом или электростатическом взаимодействия с неподвижными фазами. Таким образом, небольшая молекула, которая может проникнуть в каждую область системы пор неподвижной фазы, может войти в общий объем, равный сумме всего объема пор и объема между частицами. Эта небольшая молекула элюируется поздно (после того, как молекула проникает через весь объем пор и между частицами - примерно 80% объема колонки). С другой стороны, очень большая молекула, которая не может проникнуть ни в какие поры меньшего размера, может войти только в межчастичный объем (~ 35% объема колонки) и элюируется раньше, когда этот объем подвижной фазы пройдет через колонку. Основополагающий принцип SEC состоит в том, что частицы разных размеров элюируются (фильтруются) через неподвижную фазу с разной скоростью. Это приводит к разделению раствора на частицы по размеру. При условии, что все частицы загружаются одновременно или почти одновременно, частицы одного размера должны элюироваться вместе.

Однако, поскольку существуют различные меры размера макромолекулы (например, радиус вращения и гидродинамический радиус), фундаментальной проблемой в теории SEC была выбор правильного параметра размера молекул, по которому разделяются молекулы разных типов. Экспериментально Бенуа и его сотрудники обнаружили отличную корреляцию между объемом элюирования и динамически основанным размером молекулы, гидродинамическим объемом, для нескольких различных структур цепи и химического состава. Наблюдаемая корреляция по гидродинамическому объему была принята за основу универсальной калибровки SEC.

Тем не менее, использование гидродинамического объема, размера, основанного на динамических свойствах, при интерпретации данных SEC до конца не изучено. Это связано с тем, что SEC обычно работает в условиях низкого расхода, когда гидродинамический фактор не должен иметь большого влияния на разделение. Фактически, как теория, так и компьютерное моделирование предполагают принцип термодинамического разделения: процесс разделения определяется равновесным распределением (разделением) макромолекул растворенных веществ между двумя фазами: фаза разбавленного объемного раствора, расположенная в межузельном пространстве, и фазы замкнутого раствора в порах материала насадки колонки. На основе этой теории было показано, что параметром, соответствующим размерам для разделения полимеров в порах, является средний размер пролета (средняя максимальная проекция на линию). Хотя этот вопрос не был полностью решен, вероятно, что средний размер пролета и гидродинамический объем сильно коррелированы.

Столбец исключения размера.

Каждая столбец исключения размера имеет диапазон молекулярных масс, которые можно разделить. Предел исключения определяет молекулярную массу на верхнем конце «рабочего» диапазона колонки, где молекулы слишком велики, чтобы попасть в стационарную фазу. Нижний предел диапазона определяется пределом проницаемости, который определяет молекулярную массу молекулы, которая достаточно мала, чтобы проникнуть во все поры неподвижной фазы. Все молекулы с молекулярной массой ниже этой настолько малы, что элюируются в виде единой полосы.

Отфильтрованный раствор, который собирается в конце, известен как элюат . объем пустот включает любые частицы, слишком большие для проникновения в среду, а объем растворителя известен как объем колонки .

. Ниже приведены материалы, которые обычно используются для шариков пористого геля, исключая размер. хроматография

Sr. №Материал

и торговое название

Диапазон фракционирования

(молекулярная масса в Да)

1Сефадекс G-10от 0 до 700
2Сефадекс G- 25от 1000 до 5000
3Сефадекс G-50от 1500 до 30000
4Сефадекс G-75от 3000 до 70000
5Сефадекс G-100от 4000 до 150000
6Сефадекс G-150от 5000 до 300000
7Сефадекс G-200от 5000 до 800000
8Биогель P-2от 100 до 1800
9Биогель P-6от 1000 до 6000
10Биогель P-60от 3000 до 60000
11Биогель P-15015000 до 150000
12Биогель P-300от 16000 до 400000
13Сефароза 2B2 x 10 до 25 x 10
14Сефароза 4B3 x 10 до 3 x 10
15Сефароза 6Bот 10 до 20 x 10

Факторы, влияющие на фильтрацию

Рисунок, иллюстрирующий теорию, лежащую в основе эксклюзионной хроматографии

На самом деле В жизненных ситуациях частицы в растворе не имеют фиксированного размера, в результате чего вероятность того, что ap изделие, которое в противном случае было бы затруднено прохождением поры прямо мимо него. Кроме того, частицы неподвижной фазы не определены идеально; как частицы, так и поры могут различаться по размеру. Кривые элюирования, таким образом, напоминают гауссовские распределения. Стационарная фаза также может нежелательным образом взаимодействовать с частицей и влиять на время удерживания, хотя производители колонок уделяют большое внимание использованию неподвижных фаз, которые являются инертными, и сводят к минимуму эту проблему.

Как и в других формах хроматографии, увеличение длины колонки увеличивает разрешение, а увеличение диаметра колонки увеличивает ее емкость. Правильная упаковка колонки важна для максимального разрешения: переполненная колонка может разрушить поры в шариках, что приведет к потере разрешения. Недонасыщенная колонка может уменьшить относительную площадь поверхности неподвижной фазы, доступную для более мелких частиц, в результате чего эти частицы проводят меньше времени в порах. В отличие от методов аффинной хроматографии, головка растворителя в верхней части колонки может резко снизить разрешение, поскольку образец диффундирует перед загрузкой, расширяя последующее элюирование.

Анализ

В простых ручных колонках элюент собирается в постоянных объемах, известных как фракции. Чем более похожи частицы по размеру, тем больше вероятность, что они принадлежат одной фракции и не обнаруживаются отдельно. Более совершенные колонки решают эту проблему за счет постоянного контроля элюента.

Стандартизация колонки для исключения размера.

Собранные фракции часто исследуются с помощью спектроскопических методов для определения концентрации элюированных частиц. Обычными методами спектроскопического обнаружения являются показатель преломления (RI) и ультрафиолет (УФ). При элюировании спектрально схожих видов (например, во время биологической очистки) могут потребоваться другие методы для определения содержания каждой фракции. Также можно непрерывно анализировать поток элюента с помощью измерений RI, LALLS, многоуглового рассеяния лазерного света MALS, УФ и / или вязкости.

Хроматограмма SEC биологического образца .

Объем элюирования (Ve) уменьшается примерно линейно с логарифмом молекулярного гидродинамического объема. Колонки часто калибруются с использованием 4-5 стандартных образцов (например, свернутых белков с известной молекулярной массой) и образца, содержащего очень большую молекулу, такую ​​как тиреоглобулин, для определения. (Синий декстран не рекомендуется для определения Vo, поскольку он неоднороден и может давать разные результаты). Объемы элюирования стандартов делятся на объем элюирования тиреоглобулина (Ve / Vo) и наносятся на график относительно логарифма молекулярных масс стандартов..

Приложения

Биохимические приложения

В общем, SEC считается хроматографией с низким разрешением, поскольку она не очень хорошо распознает похожие виды, и поэтому часто используется для окончательной этап очистки. С помощью этого метода можно определить четвертичную структуру очищенных белков, которые имеют медленное время обмена, поскольку его можно проводить в условиях нативного раствора, сохраняя макромолекулярные взаимодействия. SEC может также анализировать белок третичную структуру, поскольку он измеряет гидродинамический объем (не молекулярную массу), что позволяет различать свернутые и развернутые версии одного и того же белка. Например, кажущийся гидродинамический радиус типичного белкового домена может составлять 14 Å и 36 Å для свернутой и развернутой форм соответственно. SEC позволяет разделить эти две формы, так как сложенная форма элюируется намного позже из-за своего меньшего размера.

Синтез полимера

SEC может использоваться как мера как размера, так и полидисперсности синтезированного полимера, то есть способности найти распределение размеров молекул полимера. Если стандарты известного размера используются ранее, то может быть построена калибровочная кривая для определения размеров представляющих интерес молекул полимера в растворителе, выбранном для анализа (часто THF ). В качестве альтернативы методы, такие как светорассеяние и / или вискозиметрия, могут быть использованы онлайн с SEC для получения абсолютных молекулярных масс, которые не зависят от калибровки с помощью стандартов с известной молекулярной массой. Из-за разницы в размерах двух полимеров с одинаковыми молекулярными массами методы абсолютного определения, как правило, более желательны. Типичная система SEC может быстро (примерно за полчаса) предоставить химикам-полимерам информацию о размере и полидисперсности образца. Препаративный SEC можно использовать для фракционирования полимера в аналитическом масштабе.

Недостаток

В SEC измеряется не столько масса, сколько гидродинамический объем молекул полимера, то есть сколько места занимает конкретная молекула полимера, когда она находится в растворе. Однако приблизительную молекулярную массу можно рассчитать из данных SEC, потому что можно найти точное соотношение между молекулярной массой и гидродинамическим объемом для полистирола. Для этого стандартно используется пенополистирол. Но соотношение между гидродинамическим объемом и молекулярной массой не одинаково для всех полимеров, поэтому можно получить только приблизительные измерения. Еще один недостаток - возможность взаимодействия неподвижной фазы с аналитом. Любое взаимодействие приводит к более позднему времени элюирования и, таким образом, имитирует меньший размер аналита.

При выполнении этого метода полосы элюирующих молекул могут быть расширены. Это может происходить из-за турбулентности, вызванной потоком молекул подвижной фазы, проходящим через молекулы неподвижной фазы. Кроме того, молекулярная термодиффузия и трение между молекулами стеклянных стенок и молекулами элюента способствуют уширению полос. Помимо уширения, полосы еще и перекрывают друг друга. В результате элюент обычно значительно разбавляется. Можно предпринять некоторые меры предосторожности, чтобы предотвратить вероятность расширения полос. Например, можно нанести образец узкой высококонцентрированной полосой наверху колонки. Чем более концентрированным будет элюент, тем эффективнее будет процедура. Однако не всегда можно сконцентрировать элюент, что можно рассматривать как еще один недостаток.

Абсолютная эксклюзионная хроматография

Абсолютная эксклюзионная хроматография (ASEC) - это метод, который соединяет прибор динамического светорассеяния (DLS) с системой эксклюзионной хроматографии для измерения абсолютного размера белков и макромолекул по мере их элюирования из хроматографической системы.

Определение «абсолютный» в этом случае заключается в том, что калибровка не требуется для получения гидродинамического размера, часто называемого гидродинамическим диаметром (D H в единицах нм). Размеры макромолекул измеряются по мере их элюирования в проточную ячейку прибора DLS из набора колонок исключения размера. Измеряется гидродинамический размер молекул или частиц, а не их молекулярный вес. Для белков можно использовать расчет по методу Марка-Хаувинка для оценки молекулярной массы по гидродинамическому размеру.

Основным преимуществом DLS в сочетании с SEC является возможность получения улучшенного разрешения DLS. Пакетная DLS выполняется быстро и просто и обеспечивает прямое измерение среднего размера, но базовое разрешение DLS составляет 3 к 1 в диаметре. Используя SEC, белки и белковые олигомеры разделяются, что позволяет разделить олигомеры. Агрегационные исследования также можно проводить с помощью ASEC. Хотя концентрация агрегата не может быть рассчитана, размер агрегата можно измерить, ограничиваясь только максимальным размером, элюируемым из колонок SEC.

Ограничения ASEC включают расход, концентрацию и точность. Поскольку для правильного построения корреляционной функции требуется от 3 до 7 секунд, можно собрать ограниченное количество точек данных по пику.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-08 04:34:44
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте