Войти
Очистка белка - это серия процессов, предназначенных для выделения одного или нескольких белков из комплекса смесь, обычно клеток, тканей или целых организмов. Очистка белка жизненно важна для характеристики функции, структуры и взаимодействия интересующего белка. В процессе очистки можно отделить белковые и небелковые части смеси и, наконец, отделить желаемый белок от всех других белков. Отделение одного белка от всех остальных обычно является наиболее трудоемким аспектом очистки белка. На этапах разделения обычно используются различия в размере белков, физико-химических свойствах, аффинности связывания и биологической активности. Чистый результат может быть назван изолятом белка .
Очистка белков бывает препаративной или аналитической. Препаративная очистка направлена на получение относительно большого количества очищенных белков для последующего использования. Примеры включают приготовление коммерческих продуктов, таких как ферменты (например, лактаза ), пищевые белки (например, соевый белок изолят) и некоторые биофармацевтические препараты (например, инсулин ). Для удаления побочных продуктов, таких как белки клетки-хозяина, часто используются несколько этапов препаративной очистки, которые представляют собой потенциальную угрозу для здоровья пациента. Аналитическая очистка производит относительно небольшое количество белок для различных исследовательских или аналитических целей, включая идентификацию, количественную оценку и изучение структуры, посттрансляционных модификаций и функций белка. Пепсин и уреаза были первыми белками, очищенными до такой степени, что они могли кристаллизоваться.
Рекомбинантные бактерии можно выращивать в колбе, содержащей питательную среду. Если интересующий белок не секретируется организмом в окружающий раствор, первой стадией каждого процесса очистки является разрушение клеток, содержащих белок. В зависимости от того, насколько хрупок белок и насколько стабильны клетки, можно, например, использовать один из следующих методов: i) многократное замораживание и оттаивание, ii) обработка ультразвуком, iii) гомогенизация под высоким давлением. (French Press ), iv) гомогенизация путем измельчения (бисерная мельница) и v) проницаемость детергентами (например, Triton X-100 ) и / или ферментами (например, лизоцимом ). Наконец, остатки клеток можно удалить центрифугированием, чтобы белки и другие растворимые соединения оставались в супернатанте.
Также протеазы высвобождаются во время клеточного лизиса, который начинает переваривать белки в растворе. Если интересующий белок чувствителен к протеолизу, рекомендуется действовать быстро и держать экстракт охлажденным, чтобы замедлить переваривание. Альтернативно, один или несколько ингибиторов протеаз можно добавить в буфер для лизиса непосредственно перед разрушением клеток. Иногда также необходимо добавить ДНКазу, чтобы снизить вязкость клеточного лизата, вызванную высоким содержанием ДНК.
При объемной очистке белков обычной первой стадией выделения белков является осаждение с помощью сульфата аммония (NH 4)2SO4. Это выполняется путем добавления увеличивающихся количеств сульфата аммония и сбора различных фракций осажденного белка. Впоследствии сульфат аммония может быть удален с помощью диализа. На стадии осаждения сульфатом аммония гидрофобные группы, присутствующие в белках, отключаются. подвергается воздействию атмосферы, привлекая другие гидрофобные группы; в результате образуется агрегат гидрофобных компонентов. В этом случае осадок белка обычно виден невооруженным глазом . Одним из преимуществ этого метода является то, что это можно сделать недорого, даже при очень больших объемах.
Первыми очищаемыми белками являются водорастворимые белки. Для очистки интегральных мембранных белков требуется разрушение клеточной мембраны в порядке чтобы изолировать один конкретный белок от других, находящихся в том же мембранном отсеке. Иногда конкретная мембранная фракция может быть выделена первой, например, выделение митохондрий из клеток перед очисткой белка, расположенного в митохондриальной мембране. детергент, такой как додецилсульфат натрия (SDS), можно использовать для растворения клеточных мембран и удержания мембранных белков в растворе во время очистки; однако, поскольку SDS вызывает денатурацию, можно использовать более мягкие детергенты, такие как Triton X-100 или CHAPS, для сохранения нативной конформации белка во время полной очистки.
Центрифугирование - это процесс, в котором используется центробежная сила для разделения смесей частиц различной массы или плотности, взвешенных в жидкости. Когда сосуд (обычно пробирка или флакон), содержащий смесь белков или других твердых частиц, таких как бактериальные клетки, вращается с высокой скоростью, инерция каждой частицы создает силу в направлении скорость частицы пропорциональна ее массе. Тенденция данной частицы перемещаться через жидкость из-за этой силы компенсируется сопротивлением, которое жидкость оказывает частице. Общий эффект «вращения» образца в центрифуге заключается в том, что массивные, маленькие и плотные частицы движутся наружу быстрее, чем менее массивные частицы или частицы с большим «сопротивлением» в жидкости. Когда суспензии частиц «вращаются» в центрифуге, на дне сосуда может образовываться «осадок», который обогащается наиболее массивными частицами с низким сопротивлением жидкости.
Неуплотненные частицы остаются в основном в жидкости, называемой «супернатант», и их можно удалить из сосуда, тем самым отделив супернатант от осадка. Скорость центрифугирования определяется угловым ускорением, приложенным к образцу, обычно измеряемым по сравнению с g. Если образцы центрифугируются достаточно долго, частицы в сосуде достигают равновесия, при котором частицы накапливаются именно в той точке сосуда, где их плавучая плотность уравновешивается центробежной силой. Такое «равновесное» центрифугирование может обеспечить обширную очистку данной частицы.
Центрифугирование в градиенте сахарозы - в пробирке создается линейный градиент концентрации сахара (обычно сахароза, глицерин или среда с градиентом плотности на основе диоксида кремния, например Percoll ), так что максимальная концентрация снизу и снизу сверху. Percoll - торговая марка, принадлежащая компаниям GE Healthcare. Затем образец белка наслаивают поверх градиента и вращают с высокой скоростью в ультрацентрифуге. Это заставляет тяжелые макромолекулы перемещаться к дну пробирки быстрее, чем более легкий материал. Во время центрифугирования в отсутствие сахарозы, поскольку частицы перемещаются все дальше и дальше от центра вращения, они испытывают все большую и большую центробежную силу (чем дальше они движутся, тем быстрее они движутся). Проблема заключается в том, что полезный диапазон разделения внутри емкости ограничен небольшим окном наблюдения. Вращение образца в два раза больше не означает, что интересующая частица уйдет вдвое дальше, фактически, она пойдет значительно дальше. Однако, когда белки движутся через градиент сахарозы, они сталкиваются с жидкостью увеличивающейся плотности и вязкости. Правильно спроектированный градиент сахарозы будет противодействовать возрастающей центробежной силе, поэтому частицы перемещаются пропорционально времени, в течение которого они находились в центробежном поле. Образцы, разделенные этими градиентами, называются центрифугированием с "зональной скоростью". После разделения белка / частиц градиент фракционируют и собирают.
Хроматографическое оборудование. Здесь настроена эксклюзионная хроматография. Буфер прокачивается через колонку (справа) с помощью устройства, управляемого компьютером. Выбор исходного материала является ключом к разработке процесса очистки. У растений или животных определенный белок обычно неравномерно распределяется по организму; разные органы или ткани имеют более высокие или более низкие концентрации белка. Использование только тканей или органов с самой высокой концентрацией уменьшает объемы, необходимые для производства определенного количества очищенного белка. Если белок присутствует в небольшом количестве или имеет высокую ценность, ученые могут использовать технологию рекомбинантной ДНК для разработки клеток, которые будут производить большие количества желаемого белка (это известно как система выражения ). Рекомбинантная экспрессия позволяет маркировать белок, например с помощью His-метки или Strep-tag для облегчения очистки, уменьшая количество требуемых стадий очистки.
При аналитической очистке обычно используются три свойства для разделения белков. Во-первых, белки можно очистить в соответствии с их изоэлектрическими точками, пропустив их через гель с регулируемым уровнем pH или ионообменную колонку. Во-вторых, белки можно разделить в соответствии с их размером или молекулярной массой с помощью эксклюзионной хроматографии или с помощью SDS-PAGE (электрофорез в геле додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле). Белки часто очищают с помощью 2D-PAGE, а затем анализируют с помощью фингерпринта пептидной массы для установления идентичности белка. Это очень полезно для научных целей, а пределы обнаружения белка в настоящее время очень низкие, и количество белка в нанограммах является достаточным для их анализа. В-третьих, белки могут быть разделены по полярности / гидрофобности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или обращенно-фазовой хроматографии.
Обычно протокол очистки белка содержит одну или несколько хроматографических стадий. Основная процедура хроматографии - пропустить раствор, содержащий белок, через колонку, заполненную различными материалами. Различные белки по-разному взаимодействуют с материалом колонки и, таким образом, могут быть разделены по времени, необходимому для прохождения через колонку, или по условиям, необходимым для элюирования белка из колонки. Обычно белки обнаруживаются по мере их выхода из колонки по их поглощению при 280 нм. Существует множество различных хроматографических методов:
Хроматография может использоваться для разделения белка в растворе или денатурирующих условиях с использованием пористых гелей. Этот метод известен как эксклюзионная хроматография. Принцип состоит в том, что молекулы меньшего размера должны проходить через больший объем пористой матрицы. Следовательно, белки определенного диапазона размеров потребуют переменного объема элюента (растворителя) перед их сбором на другом конце колонки с гелем.
В контексте очистки белка элюент обычно объединяют в разные пробирки. Все пробирки, не содержащие поддающихся измерению следов белка, подлежащего очистке, выбрасывают. Таким образом, оставшийся раствор состоит из очищаемого белка и любых других белков аналогичного размера.
Среда HIC является амфифильной, с гидрофобными и гидрофильными областями, что позволяет разделить белки на основе их поверхностной гидрофобности. Целевые белки и их агрегированные виды продуктов, как правило, имеют разные гидрофобные свойства, и их удаление с помощью HIC дополнительно очищает интересующий белок. Кроме того, в используемой среде обычно используются менее жесткие денатурирующие условия, чем при других методах хроматографии, что помогает сохранить интересующий белок в его естественном и функциональном состоянии. В чистой воде взаимодействия между смолой и гидрофобными участками белка были бы очень слабыми, но это взаимодействие усиливается путем нанесения образца белка на смолу HIC в буфере с высокой ионной силой. Затем ионная сила буфера снижается для элюирования белков в порядке уменьшения гидрофобности.
Ионообменная хроматография разделяет соединения в соответствии с природой и степенью их ионного заряда. Используемая колонка выбирается в зависимости от ее типа и силы заряда. Анионообменные смолы имеют положительный заряд и используются для удержания и разделения отрицательно заряженных соединений (анионов), в то время как катионообменные смолы имеют отрицательный заряд и используются для разделения положительно заряженных молекул (катионов).
Перед началом разделения через колонку прокачивают буфер, чтобы уравновесить противоположно заряженные ионы. После введения образца молекулы растворенного вещества будут обмениваться с ионами буфера, поскольку каждая из них будет бороться за участки связывания на смоле. Продолжительность удержания каждого растворенного вещества зависит от силы его заряда. Сначала элюируются наиболее слабо заряженные соединения, а затем соединения с более сильным зарядом. Из-за природы механизма разделения pH, тип буфера, концентрация буфера и температура - все они играют важную роль в управлении разделением.
Ионообменная хроматография - очень мощный инструмент для очистки белков, который часто используется как для аналитического, так и для препаративного разделения.
Никель -аффинная колонка. Смола синего цвета, так как она содержит связанный никель. Электрофорез в свободном потоке (FFE) - это метод электрофореза без носителя, который позволяет препаративное разделение белков в ламинарном буферном потоке с использованием ортогональное электрическое поле. Благодаря использованию градиента pH, который, например, может быть вызван амфолитами, этот метод позволяет разделять изоформы белка с разрешением < 0.02 delta-pI.
Аффинная хроматография - это метод разделения, основанный на молекулярной конформации, при котором часто используются смолы, специфичные для конкретного применения. Эти смолы имеют лиганды, прикрепленные к их поверхностям, которые являются специфическими для разделяемых соединений. Чаще всего эти лиганды действуют аналогично взаимодействиям антитело-антиген. Этот «замок и ключ» между лигандом и его целевым соединением делает его очень специфичным, часто генерируя единственный пик, в то время как все остальное в образце не сохраняется.
Многие мембранные белки являются гликопротеинами и могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии на лектине. Солюбилизированным детергентом белкам можно дать возможность связываться с хроматографической смолой, которая была модифицирована, чтобы иметь ковалентно присоединенный лектин. Белки, которые не связываются с лектином, вымываются, а затем специфически связанные гликопротеины могут быть элюированы путем добавления сахара в высокой концентрации, который конкурирует со связанными гликопротеинами в сайте связывания лектина. Некоторые лектины обладают высокой аффинностью связывания с олигосахаридами гликопротеинов, которые трудно конкурировать с сахарами, и связанные гликопротеины необходимо высвобождать путем денатурирования лектина.
ВЭЖХ. Слева направо: насосное устройство, генерирующее градиент двух различных растворителей, усиленная сталью колонка и устройство для измерения оптической плотности. Иммуноаффинная хроматография использует специфическое связывание антитела -антигена для селективного очистить целевой белок. Процедура включает в себя иммобилизацию белка на твердом субстрате (например, пористом шарике или мембране), который затем избирательно связывает цель, в то время как все остальное проходит через него. Целевой белок может быть элюирован путем изменения pH или солености. Иммобилизованный лиганд может быть антителом (таким как иммуноглобулин G ) или он может быть белком (таким как протеин A ). Поскольку этот метод не требует разработки тега, его можно использовать для белков из природных источников.
Другой способ пометить белки - это разработать пептидную метку антигена на белок, а затем очистить белок на колонке или путем инкубации с рыхлой смолой, покрытой иммобилизованным антителом. Эта конкретная процедура известна как иммунопреципитация. Иммунопреципитация вполне способна генерировать чрезвычайно специфическое взаимодействие, которое обычно приводит к связыванию только желаемого белка. Затем очищенные меченые белки можно легко отделить от других белков в растворе, а затем элюировать обратно в чистый раствор.
Когда теги больше не нужны, они могут быть отщеплены протеазой. Это часто включает конструирование сайта расщепления протеазой между меткой и белком.
Высокоэффективная жидкостная хроматография или жидкостная хроматография высокого давления - это форма хроматографии, в которой применяется высокое давление для более быстрого продвижения растворенных веществ через колонку. Это означает, что диффузия ограничена, а разрешение улучшено. Наиболее распространенной формой является ВЭЖХ с «обращенной фазой», где материал колонки гидрофобен. Белки элюируются градиентом возрастающих количеств органического растворителя, такого как ацетонитрил. Белки элюируются в соответствии с их гидрофобностью. После очистки с помощью ВЭЖХ белок находится в растворе, который содержит только летучие соединения, и его можно легко лиофилизировать. Очистка с помощью ВЭЖХ часто приводит к денатурации очищенных белков и, таким образом, неприменима к белкам, которые не образуют спонтанной складки.
Селективно проницаемая мембрана может быть установлена в центрифужной пробирке. Буфер проталкивается через мембрану центрифугированием, оставляя белок в верхней камере. В конце очистки белка часто приходится концентрировать белок. Существуют разные методы.
Если раствор не содержит никаких других растворимых компонентов, кроме рассматриваемого белка, белок может быть лиофилизирован (высушен). Обычно это делается после анализа ВЭЖХ. Это просто удаляет все летучие компоненты, оставляя белки позади.
Ультрафильтрация концентрирует белковый раствор с использованием селективных проницаемых мембран. Функция мембраны - пропускать воду и небольшие молекулы, сохраняя при этом белок. Раствор прижимается к мембране механическим насосом, давлением газа или центрифугированием.
Самым общим методом мониторинга процесса очистки является выполнение SDS-PAGE различных стадий. Этот метод дает лишь приблизительную оценку количеств различных белков в смеси, и он не позволяет различить белки с похожей кажущейся молекулярной массой.
, если белок имеет отличительную спектроскопическую или ферментативная активность, это свойство можно использовать для обнаружения и количественной оценки конкретного белка и, таким образом, для выбора фракций разделения, которые содержат белок. Если антитела против белка доступны, то вестерн-блоттинг и ELISA могут специфически определять и количественно определять количество желаемого белка. Некоторые белки функционируют как рецепторы и могут быть обнаружены на этапах очистки с помощью анализа связывания лиганда, часто с использованием радиоактивного лиганда.
для оценки процесса многоступенчатой очистки количество конкретного белка должно сравниваться с количеством общего белка. Последний может быть определен с помощью анализа общего белка по Брэдфорду или по поглощению света при 280 нм, однако некоторые реагенты, используемые в процессе очистки, могут мешать количественному определению. Например, имидазол (обычно используемый для очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином) является аналогом аминокислоты и в низких концентрациях будет мешать анализу бицинхониновой кислоты (BCA) для общего белка. количественная оценка. Примеси в имидазоле низкого качества также будут поглощать на длине волны 280 нм, что приведет к неточному измерению концентрации белка по поглощению УФ-излучения.
Еще один метод, который следует учитывать, - это поверхностный плазмонный резонанс (SPR). SPR может обнаруживать связывание свободных от меток молекул на поверхности чипа. Если желаемый белок представляет собой антитело, связывание может быть напрямую переведено на активность белка. Активную концентрацию белка можно выразить как процент от общего белка. SPR может быть мощным методом для быстрого определения активности белка и общего выхода. Это мощная технология, для работы которой необходим инструмент.
Гель-электрофорез - это распространенный лабораторный метод, который можно использовать как препаративный, так и аналитический метод. Принцип электрофореза основан на движении заряженного иона в электрическом поле. На практике белки денатурируют в растворе, содержащем детергент (SDS ). В этих условиях белки разворачиваются и покрываются отрицательно заряженными молекулами детергента. Белки в SDS-PAGE разделены исключительно на основании их размера.
В аналитических методах белок перемещается в виде полос в зависимости от размера. Каждую полосу можно обнаружить с помощью красителей, таких как кумасси синий краситель или серебряный краситель. Препаративные методы очистки больших количеств белка требуют экстракции белка из электрофоретического геля. Эта экстракция может включать удаление геля, содержащего полосу, или элюирование полосы непосредственно с геля, когда она стекает с конца геля.
В контексте стратегии очистки электрофорез в денатурирующих условиях обеспечивает улучшенное разрешение по сравнению с эксклюзионной хроматографией, но не масштабируется до большого количества белков в образце, а также колонок для поздней хроматографии .
Оборудование для препаративного гель-электрофореза: камера для электрофореза, перистальтический насос, коллектор фракций, буферный рециркуляционный насос и УФ-детектор (в холодильнике), блок питания и регистратор (на столе) A Неденатурирующая электрофоретическая процедура для выделения биоактивных металлопротеинов в сложных белковых смесях представляет собой препаративный нативный PAGE. Целостность или структурная целостность выделенного белка должна быть подтверждена независимым методом.
