Войти
Перекрестный иммуноэлектрофорез 2 мкл нормальной сыворотки человека. Электрофорез проводили в тонких слоях агарозы, размер геля на фото около 7x7 см. Нижняя часть представляет собой гель первого измерения без антител, в котором сыворотка вводилась в щель в нижнем левом углу. Верхняя часть представляет собой гель второго измерения с антителами Дако против белков сыворотки крови человека. Можно назвать более 50 основных белков сыворотки. 
Слитый иммуноэлектрофорез с использованием аффинной хроматографии разделения белков сыворотки крови человека на con A. Наносят образец объемом 15 микролитров из каждой фракции (начиная слева) и оставляют для диффузии примерно в течение часа, затем в течение ночи проводят электрофорез. Пик «a» не сохраняется, пик «b» сохраняется и элюируется метилманнозой, стрелка указывает на белки, слабо удерживаемые сомом. Иммуноэлектрофорез - это общее название ряда биохимических методов разделения и характеристики белков на основе электрофореза и реакции с антителами. Все варианты иммуноэлектрофореза требуют иммуноглобулинов, также известных как антитела, реагирующих с белками, которые необходимо разделить или охарактеризовать. Эти методы были разработаны и широко использовались во второй половине 20 века. В некотором хронологическом порядке: иммуноэлектрофорез (одномерный иммуноэлектрофорез ad modum Grabar), перекрестный иммуноэлектрофорез (двумерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Clarke и Freeman или ad modum Laurell), ракетный иммуноэлектрофорез (одномерный количественный иммуноэлектрофорез) иммуноэлектрофорез слитой ракеты ad modum Svendsen and Harboe, аффинный иммуноэлектрофорез ad modum Bøg-Hansen.
Агароза в виде пластинок 1% геля толщиной около 1 мм, забуференных при высоком pH (около 8,6), традиционно является предпочтительным для электрофореза, а также для реакции с антитела. Агароза была выбрана в качестве гелевой матрицы, поскольку она имеет большие поры, позволяющие свободное прохождение и разделение белков, но обеспечивает якорь для иммунопреципитатов белка и специфических антител. Был выбран высокий pH, потому что антитела практически неподвижны при высоком pH. Обычно для электрофореза рекомендуется оборудование для электрофореза с горизонтальной охлаждающей пластиной.
Иммунопреципитаты можно увидеть во влажном агарозном геле, но они окрашены белками, такими как кумасси бриллиантовый синий в высушенном геле. В отличие от гель-электрофореза SDS- , электрофорез в агарозе позволяет создавать нативные условия, сохраняя нативную структуру и активность исследуемых белков, поэтому иммуноэлектрофорез позволяет охарактеризовать активности фермента и связывание лиганда. и др. в дополнение к электрофоретическому разделению.
Иммуноэлектрофорезный анализ ad modum Grabar представляет собой классический метод иммуноэлектрофореза. Белки разделяют электрофорезом, затем антитела наносят в желоб рядом с отделенными белками, и после периода диффузии отделенных белков и антител друг против друга образуются иммунопреципитаты. Внедрение иммуноэлектрофорезного анализа дало большой импульс химии белков, одними из самых первых результатов было разделение белков в биологических жидкостях и биологических экстрактах. Среди важных наблюдений было большое количество различных белков в сыворотке крови, существование нескольких классов иммуноглобулинов и их электрофоретическая гетерогенность.
Глутаматдегидрогеназа плазмодия (pGluDH), разделенная с помощью Контриммуноэлектрофореза Перекрестный иммуноэлектрофорез также называется двумерным количественным иммуноэлектрофорезом ad modum Clarke и Freeman или ad modum Laurell. В этом методе белки сначала разделяются во время электрофореза в первом измерении, затем вместо диффузии к антителам белки подвергаются электрофорезу в гель, содержащий антитела, во втором измерении. Иммунопреципитация будет происходить во время электрофориса второго измерения, и иммунопреципитаты имеют характерную форму колокола, каждый осадок представляет один антиген, причем положение осадка зависит от количества белка, а также количества специфических антител в геле, поэтому может быть проведена относительная количественная оценка. Чувствительность и разрешающая способность перекрестного иммуноэлектрофореза выше, чем у классического иммуноэлектрофореза, и существует множество вариаций этого метода, которые можно использовать для различных целей. Перекрестный иммуноэлектрофорез использовался для исследования белков в биологических жидкостях, особенно в сыворотке крови человека и биологических экстрактах.
Ракетный иммуноэлектрофорез представляет собой одномерный количественный иммуноэлектрофорез. Этот метод использовался для количественного определения белков сыворотки крови человека до того, как стали доступны автоматизированные методы.
Иммуноэлектрофорез слитной ракетой - это модификация одномерного количественного иммуноэлектрофореза, используемого для детального измерения белков во фракциях из экспериментов по разделению белков.
Аффинный иммуноэлектрофорез основан на изменениях в электрофоретическом характере белков за счет специфического взаимодействия или образования комплекса с другими макромолекулами или лигандами. Аффинный иммуноэлектрофорез использовался для оценки констант связывания, например, с лектинами или для характеристики белков с конкретными характеристиками, такими как гликан содержание или лиганд связывание. Некоторые варианты аффинного иммуноэлектрофореза аналогичны аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных лигандов.
. Открытая структура иммунопреципитата в агарозном геле позволит дополнительное связывание радиоактивно меченых антител для выявления специфических белков. Этот вариант был использован для идентификации аллергенов посредством реакции с IgE.
Два фактора определяют, что иммуноэлектрофоретические методы не получили широкого распространения. Во-первых, они довольно трудоемкие и требуют некоторого ручного опыта. Во-вторых, они требуют довольно большого количества поликлональных антител. Сегодня гель-электрофорез с последующим электроблоттингом является предпочтительным методом определения характеристик белков, поскольку он прост в эксплуатации, имеет высокую чувствительность и низкую потребность в специфических антителах. Кроме того, белки разделяют с помощью гель-электрофореза на основе их кажущейся молекулярной массы, что не достигается иммуноэлектрофорезом, но, тем не менее, иммуноэлектрофорезные методы все еще применимы, когда необходимы невосстанавливающие условия.
