Войти
В молекулярной биологии, рестрикционный фрагмент длина полиморфизм ( ПДРФ) представляет собой метод, который использует изменения в гомологичных ДНК последовательностей, известные как полиморфизмы, для того, чтобы различать отдельные лицо, группы население, или виды, или, чтобы точно определить местоположение генов в пределах последовательности. Термин может относиться к самому полиморфизму, обнаруживаемому через различные местоположения сайтов рестрикционных ферментов, или к родственной лабораторной методике, с помощью которой можно проиллюстрировать такие различия. В ПДРФ-анализе образец ДНК расщепляется на фрагменты одним или несколькими рестрикционными ферментами, а полученные рестрикционные фрагменты затем разделяются гель-электрофорезом в соответствии с их размером.
Хотя в настоящее время в значительной степени устаревшие из-за появления недорогих технологий секвенирования ДНК, ПДРФ-анализ был первым достаточно недорогим методом профилирования ДНК, чтобы найти широкое применение. ПДРФ-анализ был важным ранним инструментом в картировании генома, локализации генов генетических нарушений, определении риска заболевания и проверке отцовства.
Основной метод обнаружения RFLP включает фрагментацию образца ДНК с применением рестрикционного фермента, который может выборочно расщеплять молекулу ДНК везде, где распознается короткая конкретная последовательность, в процессе, известном как рестрикционный гидролизат. Фрагменты ДНК, полученные в результате переваривания, затем разделяют по длине с помощью процесса, известного как электрофорез в агарозном геле, и переносят на мембрану с помощью процедуры саузерн-блоттинга. Гибридизация мембраны с меченым ДНК-зондом затем определяет длину фрагментов, которые комплементарны зонду. Считается, что полиморфизм длины рестрикционного фрагмента возникает, когда длина детектируемого фрагмента варьируется у разных индивидуумов, что указывает на неодинаковую гомологию последовательностей. Длина каждого фрагмента считается аллелем, независимо от того, содержит ли он кодирующую область или нет, и может использоваться в последующем генетическом анализе.
Схема для RFLP по потере сайта расщепления 
Анализ и наследование аллельных фрагментов ПДРФ (NIH) 
Схема для RFLP по вариации длины VNTR Существует два общих механизма, с помощью которых может варьироваться размер конкретного рестрикционного фрагмента. На первой схеме небольшой сегмент генома обнаруживается ДНК-зондом (более толстая линия). В аллеле А геном расщепляется рестрикционным ферментом в трех соседних сайтах (треугольниках), но зондом будет обнаружен только крайний правый фрагмент. В аллеле а сайт рестрикции 2 был потерян в результате мутации, поэтому зонд теперь обнаруживает более крупный слитый фрагмент, идущий от сайтов 1 к 3. Вторая диаграмма показывает, как это изменение размера фрагмента будет выглядеть на Саузерн-блоте и как каждый аллель (по два на человека) могут передаваться по наследству от членов семьи.
На третьей схеме зонд и рестрикционный фермент выбираются для обнаружения области генома, которая включает сегмент тандемного повтора с переменным числом (VNTR) (прямоугольники на схематической диаграмме). В аллеле c имеется пять повторов в VNTR, и зонд обнаруживает более длинный фрагмент между двумя сайтами рестрикции. В аллеле d есть только два повтора в VNTR, поэтому зонд обнаруживает более короткий фрагмент между теми же двумя сайтами рестрикции. Другие генетические процессы, такие как вставки, делеции, транслокации и инверсии, также могут приводить к полиморфизму. Для тестов RFLP требуются образцы ДНК гораздо большего размера, чем для тестов с коротким тандемным повторением (STR).
Анализ вариабельности ПДРФ в геномах раньше был жизненно важным инструментом в картировании генома и анализе генетических заболеваний. Если бы исследователи пытались первоначально определить хромосомное расположение гена определенного заболевания, они бы проанализировали ДНК членов семьи, пораженной этим заболеванием, и искали бы аллели RFLP, которые показывают аналогичный образец наследования, как у самого заболевания (см. генетическая связь ). Как только ген болезни был локализован, RFLP-анализ других семейств мог выявить, кто подвергался риску заболевания или кто мог быть носителем мутантных генов. RFLP-тест используется для идентификации и дифференциации организмов путем анализа уникальных паттернов в геноме. Он также используется для определения скорости рекомбинации в локусах между сайтами рестрикции.
Анализ ПДРФ также послужил основой для ранних методов генетического дактилоскопирования, полезных для идентификации образцов, взятых с мест преступлений, для определения отцовства и для характеристики генетического разнообразия или моделей размножения в популяциях животных.
Однако методика анализа RFLP медленная и громоздкая. Для этого требуется большое количество образца ДНК, а объединенный процесс мечения зонда, фрагментации ДНК, электрофореза, блоттинга, гибридизации, отмывки и авторадиографии может занять до месяца. Об ограниченной версии метода RFLP, в котором использовались олигонуклеотидные зонды, было сообщено в 1985 году. Результаты проекта Human Genome Project в значительной степени заменили потребность в картировании RFLP и идентификации многих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этом проекте (а также как прямая идентификация многих генов болезней и мутаций) заменила потребность в анализе связи болезней RFLP (см. генотипирование SNP ). Анализ аллелей VNTR продолжается, но в настоящее время обычно выполняется методами полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, стандартные протоколы для снятия отпечатков пальцев ДНК включают ПЦР анализ панелей более чем дюжины VNTRs.
RFLP все еще используется в отборе с помощью маркеров. Полиморфизм длины терминального рестрикционного фрагмента (TRFLP или иногда T-RFLP) - это метод, первоначально разработанный для характеристики бактериальных сообществ в смешанных образцах. Этот метод также применялся к другим группам, включая почвенные грибы. TRFLP работает путем ПЦР-амплификации ДНК с использованием пар праймеров, помеченных флуоресцентными метками. Затем продукты ПЦР расщепляют с использованием ферментов RFLP, и полученные картины визуализируются с помощью секвенатора ДНК. Результаты анализируются либо простым подсчетом и сравнением полос или пиков в профиле TRFLP, либо путем сопоставления полос из одного или нескольких прогонов TRFLP с базой данных известных видов. Методика в некоторых аспектах похожа на электрофорез в градиенте температуры или денатурирующий градиент геля (TGGE и DGGE).
Изменения последовательности, непосредственно связанные с RFLP, также можно быстрее проанализировать с помощью ПЦР. Амплификация может быть направлена через измененный сайт рестрикции, а продукты перевариваются рестрикционным ферментом. Этот метод получил название расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS). Альтернативно, амплифицированный сегмент можно анализировать с помощью зондов аллель-специфических олигонуклеотидов (ASO), процесс, который часто можно выполнить с помощью простого дот-блоттинга.
