Войти
В молекулярном клонировании вектор представляет собой молекулу ДНК, используемую в качестве носителя для искусственного переноса чужеродных генетический материал в другую клетку, где он может быть реплицирован и / или экспрессирован (например, плазмида, космида, лямбда-фаги ). Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК. Четыре основных типа векторов - это плазмиды, вирусные векторы, космиды и искусственные хромосомы. Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. Общие для всех сконструированных векторов имеют точку начала репликации, сайт многоклонирования и селективный маркер.
. Сам вектор обычно представляет собой ДНК последовательность, которая состоит из вставки (трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Назначение вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в целевой клетке. Все векторы могут быть использованы для клонирования и поэтому являются векторами клонирования, но есть также векторы, разработанные специально для клонирования, тогда как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белков. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются векторами экспрессии и обычно имеют последовательность промотора, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для усиления их вставки.
Манипуляции с ДНК обычно проводят с векторами E. coli, которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E. coli. Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, таком как клетки дрожжей, растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами. Такие векторы содержат бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть перенесены в небактериальный организм-хозяин, однако были разработаны и другие векторы, называемые внутригенными векторами, чтобы избежать переноса любого генетического материала от чужеродных видов.
Вставка вектор в клетку-мишень обычно называется трансформация для бактериальных клеток, трансфекция для эукариотических клеток, хотя вставка вирусного вектора часто называется трансдукцией.
Плазмиды двухцепочечные внехромосомные и обычно кольцевые последовательности ДНК, способные к репликации с использованием репликационного аппарата клетки-хозяина. Плазмидные векторы минималистично состоят из ориджина репликации, что делает возможным полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко обнаружены у многих бактерий, например, в Escherichia coli, но могут также быть обнаружены у некоторых эукариот, например, в дрожжах, таких как Saccharomyces cerevisiae. Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными / трансмиссивными и неконъюгативными:
Плазмида pBR322 является одной из первые плазмиды, широко используемые в качестве вектора клонирования.. Плазмиды со специально сконструированными свойствами обычно используются в лаборатории для целей клонирования. Эти плазмиды, как правило, не являются конъюгативными, но могут иметь гораздо больше функций, в частности «сайт множественного клонирования », где множество сайтов расщепления ферментом рестрикции позволяют встраивать вставку трансгена. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий за часы, а амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды можно использовать конкретно в качестве векторов транскрипции, и в таких плазмидах могут отсутствовать важные последовательности для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые экспрессирующими векторами, будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы, старт и стоп-кодоны..
Вирусные векторы обычно представляют собой генно-инженерные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которые были признаны неинфекционными, но все же содержат вирусные промоторы, а также трансген, что позволяет трансляцию трансгена через вирус промоутер. Однако, поскольку вирусные векторы часто не имеют инфекционных последовательностей, для крупномасштабной трансфекции им требуются вспомогательные вирусы или упаковочные линии. Вирусные векторы часто конструируют для постоянного включения вставки в геном хозяина и, таким образом, оставляют различные генетические маркеры в геноме хозяина после включения трансгена. Например, ретровирусы после вставки оставляют характерный паттерн интеграции ретровируса, который поддается обнаружению и указывает на то, что вирусный вектор встроен в геном хозяина.
Искусственные хромосомы - это искусственные хромосомы в контексте искусственных хромосом дрожжей (YAC), бактериальных искусственных хромосом (BAC) или искусственные хромосомы человека (HACs). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных необходимости искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и концевые последовательности теломеров.
Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда экспрессия требуется ген: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для создания множества копий мРНК, матрицы, на которой белок может быть произведен посредством трансляции. Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и количество генерируемых копий мРНК зависит от промотора, используемого в векторе. Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок постоянно продуцируется в фоновом режиме, или может быть индуцибельной, при этом белок экспрессируется только при определенных условиях, например, когда добавлен химический индуктор. Эти два разных типа экспрессии зависят от используемых типов промотора и оператора.
Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мыши инициирует транскрипцию только после применения дексаметазона, а промотор теплового шока Drosophilia инициируется только после высоких температур..
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например для производства мРНК in vitro. Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для продукции белка.
Экспрессионные векторы продуцируют белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией продуцируемой мРНК, поэтому для них требуется больше компонентов, чем более простые векторы только для транскрипции. Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют схожие требования, например промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и сигналы терминации.
Векторам экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:
Современные искусственно созданные векторы содержат важные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, обнаруженные только в некоторых векторах:
