Сайт-направленный мутагенез

редактировать

Сайт-направленный мутагенез - это метод молекулярной биологии, который используется для получения специфических и преднамеренные изменения последовательности ДНК гена и любых генных продуктов. Он также называется сайт-специфическим мутагенезом или олигонуклеотид-направленным мутагенезом, он используется для исследования структуры и биологической активности ДНК, РНК и белковые молекулы, и для белковой инженерии.

Сайт-направленный мутагенез является одним из наиболее важных лабораторных методов создания библиотек ДНК путем введения мутаций в последовательности ДНК. Существует множество способов достижения сайт-направленного мутагенеза, но с уменьшением затрат на синтез олигонуклеотидов, синтез искусственного гена теперь иногда используется как альтернатива сайт-направленному мутагенезу. С 2013 года разработка технологии CRISPR / Cas9, основанной на системе защиты от прокариотических вирусов, также позволила, и мутагенез можно относительно легко проводить in vivo.

Содержание

  • 1 История
  • 2 Базовый механизм
  • 3 Подходы
    • 3.1 Метод Кункеля
    • 3.2 Кассетный мутагенез
    • 3.3 Сайт-направленный мутагенез ПЦР
    • 3.4 Мутагенез цельной плазмиды
    • 3.5 Сайт-направленный in vivo методы мутагенеза
    • 3.6 CRISPR
  • 4 Приложения
  • 5 Синтез генов
  • 6 См. также
  • 7 Ссылки
  • 8 Внешние ссылки

История

Ранние попытки мутагенез с использованием радиационных или химических мутагенов не был сайт-специфичным, приводя к случайным мутациям. Аналоги нуклеотидов и других химических веществ позже были использованы для создания локальных точечных мутаций, примерами таких химических веществ являются аминопурин, нитрозогуанидин и бисульфит. Сайт-направленный мутагенез был достигнут в 1974 году в лаборатории Charles Weissmann с использованием аналога нуклеотида N-гидроксицитидина, который индуцирует переход GC в AT. Однако эти методы мутагенеза ограничены видом мутации, которую они могут достичь, и они не так специфичны, как более поздние методы сайт-направленного мутагенеза.

В 1971 г. Клайд Хатчисон и Маршалл Эдгелл показали, что можно получить мутанты с небольшими фрагментами фага ϕX174 и рестрикционной нуклеазой. Позднее Хатчисон вместе со своим сотрудником Майклом Смитом в 1978 году разработал более гибкий подход к сайт-направленному мутагенезу с использованием олигонуклеотидов в методе удлинения праймера с помощью ДНК-полимеразы. За участие в разработке этого процесса Майкл Смит позже разделил Нобелевскую премию по химии в октябре 1993 года с Кэри Б. Маллис, который изобрел полимеразную цепную реакцию <172.>Основной механизм

Основная процедура требует синтеза короткого праймера ДНК. Этот синтетический праймер содержит желаемую мутацию и комплементарен матричной ДНК вокруг сайта мутации, поэтому он может гибридизоваться с ДНК в интересующем гене. Мутация может представлять собой изменение одного основания (точечная мутация ), несколько изменений оснований, делеция или вставка. Затем однонитевой праймер удлиняют с помощью ДНК-полимеразы , которая копирует остальную часть гена. Скопированный таким образом ген содержит мутированный сайт, затем вводится в клетку-хозяин в векторе и клонируется. Наконец, мутанты отбираются посредством секвенирования ДНК для проверки того, что они содержат желаемую мутацию.

Подходы

Первоначальный метод с использованием удлинения с одним праймером был неэффективен из-за низкого выхода мутантов. Эта полученная смесь содержит как исходную немутантную матрицу, так и мутантную цепь, что дает смешанную популяцию мутантных и немутантных потомков. Кроме того, используемая матрица метилирована, в то время как мутантная цепь неметилирована, и мутанты могут быть отобраны с противоположной стороны из-за наличия системы репарации ошибочного спаривания, которая благоприятствует метилированной матричной ДНК, что приводит к меньше мутантов. С тех пор было разработано множество подходов для повышения эффективности мутагенеза.

Доступно большое количество методов для осуществления сайт-направленного мутагенеза, хотя большинство из них редко использовалось в лабораториях с начала 2000-х годов, поскольку новые методы позволяют более простые и легкие способы введения сайт-специфической мутации. в гены.

Метод Кункеля

В 1985 году был введен метод, который снижает необходимость отбора мутантов. Фрагмент ДНК, подлежащий мутации, вставляют в фагмиду, такую ​​как M13mp18 / 19, а затем трансформируют в E. coli с дефицитом двух ферментов: dUTPase (dut ) и урацил дегликозидазы (udg). Оба фермента являются частью пути репарации ДНК, который защищает бактериальную хромосому от мутаций за счет спонтанного дезаминирования dCTP в dUTP. Дефицит dUTPase предотвращает распад dUTP, что приводит к высокому уровню dUTP в клетке. Дефицит урацил дегликозидазы препятствует удалению урацила из вновь синтезированной ДНК. Поскольку двойная мутантная E.coli реплицирует ДНК фага, ее ферментативный аппарат может, следовательно, неправильно включать dUTP вместо dTTP, что приводит к образованию однонитевой ДНК, содержащей некоторое количество урацилов (ssUDNA). SsUDNA экстрагируют из бактериофага, который высвобождается в среду, а затем используют в качестве матрицы для мутагенеза. олигонуклеотид, содержащий желаемую мутацию, используется для удлинения праймера. Образующаяся гетеродуплексная ДНК состоит из одной родительской немутантной цепи, содержащей dUTP, и мутантной цепи, содержащей dTTP. Затем ДНК трансформируется в E. coli, несущий гены dut и udg дикого типа. Здесь исходная цепь ДНК, содержащая урацил, разлагается, так что почти вся полученная ДНК состоит из мутированной цепи.

Кассетный мутагенез

В отличие от других методов, кассетный мутагенез не требует удлинения праймера с использованием ДНК-полимеразы. В этом методе фрагмент ДНК синтезируется, а затем вставляется в плазмиду. Он включает расщепление рестрикционным ферментом на сайте в плазмиде и последующее лигирование пары комплементарных олигонуклеотидов, содержащих мутацию в гене, представляющем интерес для плазмиды. Обычно рестрикционные ферменты, которые разрезают плазмиду и олигонуклеотид, являются одинаковыми, что позволяет липким концам плазмиды и вставке связываться друг с другом. Этот метод может генерировать мутанты с эффективностью, близкой к 100%, но ограничен доступностью подходящих сайтов рестрикции, фланкирующих сайт, который должен быть мутирован.

Сайт-направленный мутагенез ПЦР

Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т.е. с использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий), и область, которая отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству различных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области (отдельные мутанты показаны разными цветами ниже).

Ограничение сайтов рестрикции в кассете мутагенез можно преодолеть с помощью полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидом «праймерами, так что может быть получен более крупный фрагмент, охватывающий два удобных сайта рестрикции. Экспоненциальная амплификация в ПЦР дает фрагмент, содержащий желаемую мутацию в количестве, достаточном для отделения от исходной немутированной плазмиды с помощью гель-электрофореза, который затем может быть вставлен в исходный контекст с использованием стандартных методов рекомбинантной молекулярной биологии. Есть много вариантов одной и той же техники. Самый простой метод размещает сайт мутации ближе к одному из концов фрагмента, при этом один из двух олигонуклеотидов, используемых для создания фрагмента, содержит мутацию. Это включает одностадийную ПЦР, но по-прежнему имеет присущую проблему необходимость подходящего сайта рестрикции рядом с сайтом мутации, если не используется очень длинный праймер. Следовательно, в других вариантах используются три или четыре олигонуклеотида, два из которых могут быть немутагенными олигонуклеотидами, которые покрывают два удобных сайта рестрикции и генерируют фрагмент, который может быть расщеплен и лигирован в плазмиду, тогда как мутагенный олигонуклеотид может быть комплементарным месту внутри этого фрагмента вдали от любого удобного сайта рестрикции. Эти методы требуют нескольких этапов ПЦР, чтобы конечный фрагмент, подлежащий лигированию, мог содержать желаемую мутацию. Процесс разработки для создания фрагмента с желаемой мутацией и соответствующими сайтами рестрикции может быть громоздким. Программные инструменты, такие как SDM-Assist, могут упростить этот процесс.

Мутагенез всей плазмиды

Для манипуляций с плазмидами другие методы сайт-направленного мутагенеза были заменены в основном методами, которые являются высокоэффективными, но относительно простыми, легкими в использовании и коммерчески доступными в виде набора. Примером этих методов является метод Quikchange, в котором пара комплементарных мутагенных праймеров используется для амплификации всей плазмиды в реакции термоциклирования с использованием высокоточной ДНК-полимеразы без вытеснения цепи, такой как полимераза БФУ. В результате реакции образуется кольцевая ДНК с разрывами. Матричная ДНК должна быть удалена ферментативным расщеплением с помощью рестрикционного фермента, такого как DpnI, который специфичен для метилированной ДНК. Вся ДНК, полученная из большинства штаммов Escherichia coli, будет метилирована; матричная плазмида, которая биосинтезируется в E. coli, будет поэтому перевариваться, в то время как мутантная плазмида, которая генерируется in vitro и, следовательно, неметилирована, останется непереваренной. Обратите внимание, что в этих методах двухцепочечного мутагенеза плазмиды, хотя можно использовать реакцию термоциклирования, ДНК не нужно экспоненциально амплифицировать, как в ПЦР. Напротив, амплификация является линейной, и поэтому неточно описывать их как ПЦР, поскольку цепная реакция отсутствует.

Обратите внимание, что полимераза pfu может вытеснять цепи при более высокой температуре удлинения (≥70 ° C), что может привести к провалу эксперимента, поэтому реакцию удлинения следует проводить при рекомендуемой температуре 68 ° C.. В некоторых приложениях этот метод приводит к встраиванию нескольких копий праймеров. Вариант этого метода, называемый SPRINP, предотвращает этот артефакт и использовался в различных типах сайт-направленного мутагенеза.

Другие методы, такие как сканирующий мутагенез олиго-направленных мишеней (SMOOT), могут полуслучайно комбинировать мутагенные свойства. олигонуклеотиды в мутагенезе плазмид. Этот метод позволяет создавать библиотеки мутагенеза плазмид в диапазоне от единичных мутаций до комплексного мутагенеза кодонов во всем гене.

Методы сайт-направленного мутагенеза in vivo

  • Delitto perfetto
  • Трансплантация "pop-in pop-out"
  • Прямая делеция гена и сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР и одного пригодного для повторного использования маркера
  • Прямая делеция гена и сайт-специфический мутагенез с ПЦР и одним рециклируемым маркером с использованием длинных гомологичных участков
  • Сайт-направленный мутагенез in vivo с синтетическими олигонуклеотидами

CRISPR

Так как В 2013 г. разработка технологии CRISPR -Cas9 позволила эффективно внедрять различные мутации в геном самых разных организмов. Для этого метода не требуется сайт встраивания транспозона, он не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом для.

Применения

Мутагенез с насыщением сайта - это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез насыщения в одном положении теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Сайт-направленный мутагенез используется для создания мутаций, которые могут продуцировать рационально сконструированный белок, который имеет улучшенные или особые свойства (например, инженерия белков).

Инструменты расследования - специфические мутации в ДНК позволяют рационально исследовать функции и свойства последовательности ДНК или белка. Более того, изменения отдельных аминокислот путем сайт-направленного мутагенеза в белках могут помочь понять важность посттрансляционных модификаций. Например, замена определенного серина (фосфоакцептора) на аланин (фосфо-неакцептор) в белке-субстрате блокирует присоединение фосфатной группы, тем самым позволяя исследовать фосфорилирование. Этот подход был использован для раскрытия фосфорилирования белка CBP киназой HIPK2. Другой комплексный подход - это сайт насыщающий мутагенез, где один кодон или набор кодонов может быть заменен всеми возможными аминокислотами в определенных положениях.

Коммерческое применение - Белки могут быть сконструированы для получения мутантных форм, адаптированных для конкретного применения. Например, обычно используемые моющие средства для стирки могут содержать субтилизин, форма дикого типа которого содержит метионин, который может окисляться отбеливателем, что значительно снижает активность белка в процессе. Этот метионин может быть заменен аланином или другими остатками, что делает его устойчивым к окислению, тем самым сохраняя активность белка в присутствии отбеливателя.

Синтез генов

По мере снижения стоимости синтеза олигонуклеотидов ДНК, искусственный синтез полного гена в настоящее время является жизнеспособным методом введения мутации в ген. Этот метод позволяет проводить обширный мутагенез по множеству сайтов, включая полную переработку использования кодонов гена для оптимизации его для конкретного организма.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-08 04:16:09
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте