Войти
| ДНК-полимераза I, термостабильная | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Большой (Кленовский) фрагмент Taq polA, содержащий polA и рудиментарные домены | |||||||
| Идентификаторы | |||||||
| Организм | Thermus aquaticus | ||||||
| Symbol | polA | ||||||
| UniProt | P19821 | ||||||
| |||||||
Taq-полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу I, названную в честь термофильного эубактериального микроорганизма Thermus aquaticus, из которого она была первоначально выделена Chien et al.. в 1976 году. Его название часто сокращается до Taq или Taq pol . Он часто используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР), методе значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК.
T. aquaticus - это бактерия, которая обитает в горячих источниках и гидротермальных источниках, а Taq-полимераза была идентифицирована как фермент, способный противостоять белку -условия денатурирования (высокая температура), необходимые во время ПЦР. Следовательно, он заменил ДНК-полимеразу из E. coli, первоначально использовавшегося в ПЦР.
Оптимальная температура Taq для активности составляет 75–80 ° C, с периодом полураспада более 2 часов при 92,5 ° C, 40 минут при 95 ° C и 9 минут при 97,5 ° C, и может воспроизводить 1000 пар оснований цепь ДНК менее чем за 10 секунд при 72 ° C. При 75-80 ° C Taq достигает своей оптимальной скорости полимеризации, составляющей около 150 нуклеотидов в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального диапазона температур ингибируют скорость удлинения фермента.. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 ° C, 24 нуклеотида / сек при 55 ° C, 1,5 нуклеотида / сек при 37 ° C и 0,25 нуклеотидов / сек при 22 ° C. При температурах выше 90 ° C Taq проявляет очень небольшую активность или совсем не проявляет активности, но сам фермент не денатурирует и остается нетронутым. Присутствие определенных ионов в реакционном сосуде также влияет на удельную активность фермента. Небольшие количества хлорида калия (KCl) и иона магния (Mg) способствуют ферментативной активности Taq. Полимераза Taq максимально активируется при 50 мМ KCl и нужной концентрации Mg, которая определяется концентрацией нуклеозидтрифосфатов (dNTP). Высокие концентрации KCl и Mg подавляют активность Taq. Интересно, что обычный хелатор ионов металлов, ЭДТА, напрямую связывается с Taq в отсутствие этих ионов металлов.
Одним из недостатков Taq является отсутствие в нем 3 ' к 5' экзонуклеазе проверяет активность, что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально частота ошибок составляла примерно 1 из 9000 нуклеотидов. Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, таких как ДНК-полимераза Pfu, обладающих активностью корректуры, и используются вместо (или в сочетании с) Taq для высокоточной амплификации. Верность может сильно различаться между Taq, оказывая сильное влияние на последующие приложения секвенирования.
Taq производит продукты ДНК, которые имеют выступы A (аденин ) на их 3'-концах. Это может быть полезно в клонировании ТА, посредством чего вектор клонирования (такой как плазмида ), который имеет T (тимин ) 3 'выступ, который дополняет выступ A продукта ПЦР, что позволяет лигировать продукта ПЦР в плазмидный вектор.
В начале 1980-х Кэри Маллис работала в Cetus Corporation над применением синтетических ДНК в биотехнологии. Он был знаком с использованием ДНК олигонуклеотидов в качестве зондов для связывания с целевыми цепями ДНК, а также с их использованием в качестве праймеров для секвенирования ДНК и кДНК синтез. В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизации с каждой цепью целевой ДНК, и добавил в реакцию ДНК-полимеразу. Это привело к экспоненциальной репликации ДНК, значительно усилив дискретные сегменты ДНК между праймерами.
Однако после каждого цикла репликации смесь необходимо нагреть выше 90 ° C до денатурирует вновь образованную ДНК, позволяя цепям разделиться и действовать в качестве матрицы в следующем раунде амплификации. Эта стадия нагревания также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия полимеразы Taq, фрагмент Кленова (полученный из E.coli ). Полимераза Taq хорошо подходит для этого применения, поскольку она способна выдерживать температуру 95 ° C, которая требуется для разделения цепей ДНК без денатурации.
Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~ 60 ° C и выше), что способствует высокой специфичности праймеров и снижает образование неспецифических продуктов, таких как димер праймера. Кроме того, использование термостабильной полимеразы избавляет от необходимости добавлять новый фермент в каждый цикл термоциклирования. Единственная закрытая труба в относительно простой машине может использоваться для выполнения всего процесса. Таким образом, использование Taq-полимеразы стало ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой к большому количеству проблем молекулярной биологии, касающихся анализа ДНК.
Hoffmann-La Roche в конце концов приобрела PCR и Taq патенты у Cetus за 330 миллионов долларов, из которых могла получить до 2 миллиардов долларов роялти. В 1989 г. журнал Science Magazine назвал полимеразу Taq своей первой «молекулой года ». Кэри Муллис получила Нобелевскую премию по химии в 1993 году, единственную присужденную за исследования, проведенные в компании биотехнологии. К началу 1990-х годов метод ПЦР с Taq-полимеразой использовался во многих областях, включая фундаментальные исследования молекулярной биологии, клинические испытания и судебную экспертизу. Он также начал находить неотложное применение в прямом обнаружении ВИЧ в AIDS.
. В декабре 1999 года окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 года, связанный с Taq Полимераза была выпущена частично на основании вводящей в заблуждение информации и ложных заявлений ученых из Cetus Corporation. Постановление поддержало протест Promega Corporation против Hoffman-La Roche, которая приобрела патенты Taq в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия, сделанные другими лабораториями, включая лабораторию профессора Джон Трела в Университете Цинциннати, факультет биологических наук, в качестве основы для решения.
| Taq-полимераза, экзонуклеаза | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Полная Taq-ДНК полимераза, связанная с октамером ДНК | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Символ | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOPe | 1qtm / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Taq PolA имеет общую структуру, аналогичную структуре PolA E. coli. Средний 3'-5'-домен экзонуклеазы, ответственный за корректуру, был радикально изменен и не работает. Он имеет функциональный 5'-3'-экзонуклеазный домен на амино-конце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно посредством движения связанных доменов.
экзонуклеаза полимеразы Taq - это домен, обнаруженный на аминоконце ДНК Taq полимеразы I (термостабильный). Он предполагает рибонуклеазу H-подобный мотив. Домен придает полимеразе 5 '-3' экзонуклеазную активность.
В отличие от того же домена в E. coli, который разрушает праймеры и должен быть удален расщепление для использования ПЦР, этот домен не разрушает праймер. Эта активность используется в зонде TaqMan : по мере образования дочерних цепей зонды, комплементарные матрице, входят в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные кусочки.
Полимераза Taq связывается в своем расщеплении активного сайта полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Поскольку полимераза Taq находится в контакте со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Та же область полимеразы Taq, которая связана с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры, связанные с полимеразой Taq, имеют разные взаимодействия.
A сайт-направленный мутагенез Об эксперименте, улучшающем экспериментальную 3'-5'-экзонуклеазную активность в 2 раза, сообщалось, но никогда не сообщалось, снижает ли это количество ошибок. Следуя аналогичной линии мысли, химерные белки были получены путем сбора вишневых доменов из E. coli, Taq и T. neapolitana полимераза I. Замена рудиментарного домена на функциональный из E. coli позволила создать белок с возможностью корректирующего считывания, но с более низкой оптимальной температурой и низкой термостабильностью.
Версии полимеразы без 5 Был получен домен экзонуклеазы «-3», среди которых наиболее известны Klentaq или фрагмент Stoffel. Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты подходящими для праймеров, которые проявляют вторичную структуру, а также для копирования кольцевых молекул. Другие варианты включают использование Klentaq с высокоточной полимеразой, термосеквеназой, которая распознает субстраты, подобные ДНК-полимеразе Т7, мутанты с более высокой толерантностью к ингибиторам или версии с «доменной меткой», которые имеют дополнительный мотив вокруг каталитический сайт для более плотного удержания ДНК, несмотря на неблагоприятные условия.
Taq-полимераза Благодаря улучшениям Taq-полимеразы, обеспечиваемой при репликации ДНК ПЦР: более высокая специфичность, меньше неспецифических продуктов и более простые процессы и оборудование, оно сыграло важную роль в усилиях по выявлению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных привередливыми патогенами, определения чувствительности к противомикробным препаратам медленно растущих организмов и определения количества инфекции». Внедрение Taq-полимеразы спасло бесчисленное количество жизней. Он сыграл важную роль в выявлении многих самых страшных заболеваний в мире, включая туберкулез, стрептококковый фарингит, атипичную пневмонию, СПИД, корь, гепатит и язвенные урогенитальные инфекции. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий конкретных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний за счет нацеливания на конкретную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и увеличения следовых количеств индикативных последовательностей путем их копирования до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод выявления заболеваний, особенно для ВИЧ, он не выполняется так часто, как альтернативные, более низкие тесты из-за относительно высоких затрат, трудозатрат и времени.
Использование Taq-полимеразы в качестве катализатора процесса репликации ПЦР была подчеркнута во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Нехватка необходимого фермента ограничила способность стран во всем мире производить тест-наборы для вируса. Без полимеразы Taq процесс обнаружения заболевания намного медленнее и утомителен.
Несмотря на преимущества использования полимеразы Taq при обнаружении заболеваний методом ПЦР, этот фермент не лишен недостатков. Ретровирусные заболевания: ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II; часто включают в свой геном мутации от гуанина до аденина. Подобные мутации позволяют с помощью ПЦР-тестов выявлять заболевания, но относительно низкий уровень достоверности Taq-полимеразы приводит к возникновению такой же мутации G-to-A и, возможно, к ложноположительному результату теста.
 | На Викискладе есть материалы, относящиеся к Taq-полимеразе. |
