Войти
Клонирование TA (также известное как быстрое клонирование или Т-клонирование ) - это метод субклонирования, который позволяет избежать использования рестрикционных ферментов и является более простым и быстрым, чем традиционный субклонирование. Этот метод основан на способности аденина (A) и тимина (T) (комплементарные пары оснований) на разных фрагментах ДНК гибридизоваться, а в присутствии лигазы, стали лигироваться вместе. Продукты ПЦР обычно амплифицируют с использованием ДНК-полимеразы Taq, которая предпочтительно добавляет аденин к 3'-концу продукта. Такие ПЦР-амплифицированные вставки клонируют в линеаризованные векторы, которые имеют дополнительные 3 'тимин выступы.
Схема клонирования ТА. Вставка создается с помощью ПЦР с использованием Taq-полимеразы. У этой полимеразы отсутствует активность проверки от 3 'до 5' и с высокой вероятностью она добавляет по одному выступу 3 '- аденина на каждый конец продукта ПЦР. Лучше всего, если праймеры для ПЦР содержат гуанины на 5'-конце, поскольку это максимизирует вероятность того, что ДНК-полимераза Taq добавит концевой аденозиновый выступ. Не следует использовать термостабильные полимеразы, обладающие значительной экзонуклеазной активностью от 3´ до 5´, поскольку они не оставляют выступающих 3´ аденина.
Целевой вектор линеаризуется и разрезается рестрикционный фермент с тупым концом. Затем к этому вектору добавляется дидезокситимидинтрифосфат (ddTTP) с использованием концевой трансферазы. Важно использовать ddTTP, чтобы обеспечить добавление только одного остатка T. Этот хвост оставляет вектор с одним 3'-выступающим остатком тимина на каждом тупом конце. Производители обычно продают «наборы» для клонирования ТА с широким спектром подготовленных векторов, которые уже были линеаризованы и помечены выступающим тимином.
Учитывая, что нет необходимости в рестрикционных ферментах, кроме создания линеаризованного вектора, процедура намного проще и быстрее, чем традиционное субклонирование. Также нет необходимости добавлять сайты рестрикции при разработке праймеров, и, таким образом, можно использовать более короткие праймеры, экономя время и деньги. Кроме того, в случаях, когда отсутствуют жизнеспособные сайты рестрикции, которые можно использовать для традиционного клонирования, клонирование ТА часто используется в качестве альтернативы. Основным недостатком клонирования TA является то, что направленное клонирование невозможно, поэтому вероятность клонирования гена в обратном направлении составляет 50%.
