Войти
Скопление макромолекул в цитозоле клеток изменяет свойства макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Явление макромолекулярного скопления изменяет свойства молекул в растворе, когда присутствуют высокие концентрации макромолекул, таких как белки. Такие состояния обычно возникают в живых клетках ; например, цитозоль из кишечной палочки содержит около 300-400 мг / мл макромолекул. Скученность происходит из-за того, что эти высокие концентрации макромолекул уменьшают объем растворителя, доступного для других молекул в растворе, что приводит к увеличению их эффективных концентраций. Краудинг может способствовать образованию биомолекулярного конденсата за счет разделения коллоидной фазы.
Этот эффект скопления может заставить молекулы в клетках вести себя радикально иначе, чем в тестах в пробирках. Следовательно, измерения свойств ферментов или процессов метаболизма, которые проводятся в лаборатории ( in vitro ) в разбавленных растворах, могут на много порядков отличаться от истинных значений, наблюдаемых в живых клетках ( in vivo ). Изучение биохимических процессов в условиях реалистичной скученности очень важно, поскольку эти условия являются универсальным свойством всех клеток, и скученность может иметь важное значение для эффективного функционирования метаболизма. Действительно, исследования in vitro показали, что скученность сильно влияет на стабильность связывания белков с ДНК.
Внутри кельи очень многолюдно. Например, клетка Escherichia coli имеет длину всего около 2 микрометров (мкм) и диаметр 0,5 мкм, а объем клетки составляет 0,6–0,7 мкм 3. Однако E. coli может содержать до 4288 различных типов белков, и около 1000 из них продуцируются на достаточно высоком уровне, чтобы их можно было легко обнаружить. К этой смеси добавляются различные формы РНК и хромосомы ДНК клетки, что дает общую концентрацию макромолекул от 300 до 400 мг / мл. У эукариот внутренняя часть клетки дополнительно заполнена белковыми нитями, составляющими цитоскелет, эта сеть делит цитозоль на сеть узких пор.
Объем доступного растворителя (красный) для двух молекул сильно различающихся размеров (черные кружки) при высоких концентрациях макромолекул (серые кружки). Уменьшение доступного объема увеличивает эффективную концентрацию макромолекул. Эти высокие концентрации макромолекул занимают большую часть объема клетки, что уменьшает объем растворителя, доступного для других макромолекул. Этот эффект исключенного объема увеличивает эффективную концентрацию макромолекул (увеличивая их химическую активность ), что, в свою очередь, изменяет скорости и константы равновесия их реакций. В частности, этот эффект изменяет константы диссоциации, способствуя ассоциации макромолекул, например, когда несколько белков объединяются, чтобы сформировать белковые комплексы, или когда ДНК-связывающие белки связываются со своими мишенями в геноме. Переполнение может также повлиять на ферментативные реакции с участием небольших молекул, если реакция включает большое изменение формы фермента.
Величина эффекта краудинга зависит как от молекулярной массы, так и от формы вовлеченной молекулы, хотя масса, по-видимому, является основным фактором, причем эффект сильнее с более крупными молекулами. Примечательно, что размер эффекта является нелинейным, поэтому макромолекулы подвержены гораздо более сильному воздействию, чем небольшие молекулы, такие как аминокислоты или простые сахара. Таким образом, макромолекулярное скопление - это эффект, оказываемый большими молекулами на свойства других больших молекул.
Макромолекулярное скопление - важный эффект в биохимии и клеточной биологии. Например, увеличение силы взаимодействий между белками и ДНК, продуцируемыми краудингом, может иметь ключевое значение в таких процессах, как транскрипция и репликация ДНК. Было также высказано предположение, что краудинг участвует в таких разнообразных процессах, как агрегация гемоглобина при серповидно-клеточной анемии и реакции клеток на изменения в их объеме.
Важность краудинга в сворачивании белков представляет особый интерес в биофизике. Здесь эффект краудинга может ускорить процесс сворачивания, поскольку компактный свернутый белок будет занимать меньший объем, чем развернутая белковая цепь. Однако скопление может снизить выход правильно свернутого белка за счет увеличения агрегации белка. Краудинг может также увеличивать эффективность белков-шаперонов, таких как GroEL, в клетке, что может противодействовать этому снижению эффективности сворачивания. Также было показано, что макромолекулярное краудинг влияет на динамику сворачивания белка, а также на общую форму белка, где отчетливые конформационные изменения сопровождаются вторичными структурными изменениями, подразумевая, что изменения формы, вызванные краудингом, могут быть важны для функции и нарушения функции белка in vivo.
Особенно ярким примером важности эффекта скученности являются кристаллины, заполняющие внутреннюю часть линзы. Эти белки должны оставаться стабильными и находиться в растворе, чтобы хрусталик был прозрачным; осаждение или агрегация кристаллинов вызывает катаракту. Кристаллины присутствуют в хрусталике в чрезвычайно высоких концентрациях, более 500 мг / мл, и на этих уровнях эффекты скучивания очень сильны. Большой эффект вытеснения увеличивает термическую стабильность кристаллов, увеличивая их сопротивление денатурации. Этот эффект может частично объяснить необычайную стойкость линз к повреждениям, вызванным высокими температурами.
Из-за макромолекулярного скопления ферментные анализы и биофизические измерения, проводимые в разбавленном растворе, могут не отражать фактический процесс и его кинетику, происходящие в цитозоле. Один из подходов к более точным измерениям - использовать высококонцентрированные экстракты клеток, чтобы попытаться сохранить содержимое клеток в более естественном состоянии. Однако такие экстракты содержат много видов биологически активных молекул, которые могут мешать изучаемым явлениям. Следовательно, эффект краудинга имитируется in vitro путем добавления в экспериментальную среду высоких концентраций относительно инертных молекул, таких как полиэтиленгликоль, фиколл, декстран или сывороточный альбумин. Однако использование таких искусственных агентов краудинга может быть затруднено, поскольку эти молекулы краудинга могут иногда иным образом взаимодействовать с исследуемым процессом, например, путем слабого связывания с одним из компонентов.
Большое значение макромолекулярного краудинга для биологических систем связано с его влиянием на сворачивание белков. Основной физический механизм, с помощью которого макромолекулярное скопление помогает стабилизировать белки в их свернутом состоянии, часто объясняется с точки зрения исключенного объема - объема, недоступного для белков из-за их взаимодействия с макромолекулярными скоплениями. Это понятие восходит к Асакуре и Осаве, которые описали силы истощения, вызванные стерическими, жесткими взаимодействиями. Отличительной чертой механизма, вытекающего из вышеизложенного, является то, что эффект является полностью нетепловым и, следовательно, полностью энтропийным. Эти идеи были также предложены для объяснения того, почему небольшие косолиты, а именно защитные осмолиты, которые предпочтительно исключены из белков, также смещают равновесие укладки белка в сторону свернутого состояния. Однако различными методами, как экспериментальными, так и теоретическими, было показано, что силы истощения не всегда имеют энтропийную природу.
Satyam et al. из Национального университета Ирландии в Голуэе (NUI Galway) предложил макромолекулярное скопление в качестве средства для создания эквивалентов ткани, богатой ECM. Принцип макромолекулярного скопления основан на представлении о том, что клетки in vivo находятся в очень переполненном / плотном внеклеточном пространстве, и поэтому превращение синтезированного de novo проколлагена в коллаген I происходит быстро. Однако даже в значительно более разбавленных жидкостях организма (например, моча: 36–50 г / л; кровь: 80 г / л) в условиях культивирования (например, питательная среда HAM F10: 16,55 г / л; среда DMEM / F12: 16,78 г / л; среда DMEM с высоким содержанием глюкозы и L-глутамина: 17,22 г / л), скорость преобразования проколлагена в коллаген I, ограничивающая скорость, очень медленная. Было подтверждено, что добавление инертных полидисперсных макромолекул (представленных в виде сферических объектов переменного диаметра) в культуральную среду будет способствовать усиленному производству живых заменителей, богатых ECM. Макромолекулярное скопление, имитируя локализованную плотность нативной ткани, можно использовать для эффективной модуляции микроокружения in vitro и, в конечном итоге, производить замену клеток, богатых ECM, в течение нескольких часов, а не дней или месяцев в культуре, без ущерба для основных клеточных функций.
