Войти
| Щелочная фосфатаза | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Ленточная диаграмма (цвет радуги, N-конец, = синий, С-конец = красный) димерной структуры бактериальной щелочной фосфатазы. | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Номер ЕС | 3.1.3.1 | ||||||||
| Номер CAS | 9001-78 -9 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | Представление IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Запись BRENDA | ||||||||
| ExPASy | Представление NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Запись KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| PRIAM | профиль | ||||||||
| PDB структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Онтология гена | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
| Щелочная фосфатаза | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Структура щелочной фосфатазы. | |||||||||||
| Идентификаторы | |||||||||||
| Символ | Алк_фосфатаза | ||||||||||
| Pfam | PF00245 | ||||||||||
| InterPro | IPR001952 | ||||||||||
| SMART | SM00098 | ||||||||||
| PROSITE | PDOC00113 | ||||||||||
| SCOPe | 1alk / SUPFAM | ||||||||||
| |||||||||||
Щелочная фосфатаза (ALP, ALKP, ALPase, Alk Phos ) (EC 3.1.3.1 ) или основная фосфатаза, является гомодимером белок фермент 86 килодальтон. Каждый мономер содержит пять остатков цистеина, два атома цинка и один атом магния, важные для его каталитической функции, и он оптимально активен в щелочной pH среде.
ALP выполняет физиологическую роль дефосфорилирования соединений. Фермент встречается у множества организмов, прокариот и эукариот одинаково, с одинаковой общей функцией, но в различных структурных формах, подходящих для среды, в которой они функционируют. Щелочная фосфатаза находится в периплазматическом пространстве E. coli бактерии. Этот фермент термостабилен и проявляет максимальную активность при высоком pH. У людей он встречается во многих формах в зависимости от его происхождения в организме - он играет важную роль в метаболизме в печени и развитии в скелете. Из-за его широкой распространенности в этих областях его концентрация в кровотоке используется диагностами в качестве биомаркера для определения таких диагнозов, как гепатит или остеомаляция.
Уровень щелочной фосфатазы в крови. проверяется с помощью теста ALP, который часто является частью обычных анализов крови. Уровни этого фермента в крови зависят от таких факторов, как возраст, пол или группа крови. Уровень щелочной фосфатазы в крови также увеличивается в два-четыре раза во время беременности. Это результат дополнительной щелочной фосфатазы, продуцируемой плацентой. Кроме того, аномальные уровни щелочной фосфатазы в крови могут указывать на проблемы, связанные с печенью, желчным пузырем или костями. Опухоли и инфекции почек, а также недоедание также показали аномальный уровень щелочной фосфатазы в крови. Уровни щелочной фосфатазы в клетке можно измерить с помощью процесса, называемого «метод подсчета очков». Обычно берут и окрашивают мазок крови, чтобы классифицировать каждый лейкоцит по определенным «индексам щелочной фосфатазы лейкоцитов». Этот маркер предназначен для различения лейкоцитов и определения различной активности ферментов в зависимости от степени окрашивания каждого образца.
У грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli (E. coli), щелочная фосфатаза расположена в периплазматическом пространстве, вне внутреннего клеточная мембрана и в части пептидогликана клеточной стенки. Поскольку периплазматическая щель более подвержена изменениям окружающей среды, чем внутренняя клетка, щелочная фосфатаза подходяще устойчива к инактивации, денатурации или деградации. Эта характеристика фермента необычна для многих других белков.
Точная структура и функция четырех изоферментов (Int в E.coli) предназначены исключительно для обеспечения источника неорганического фосфата, когда в окружающей среде отсутствует этот метаболит.. Четыре фермента зависят от локализации тканевой экспрессии. Четыре участка тканевой экспрессии - это кишечная ЩФ, Плацентарная ЩФ, ЩФ зародышевых клеток и ЩФ в печени / костях / почках. Неорганические фосфаты, продуцируемые этими изоферментами, затем связываются с белками-носителями, которые доставляют неорганические фосфаты в специфическую высокоаффинную транспортную систему, известную как система Pst, которая транспортирует фосфат через цитоплазматическую мембрану.
В то время как внешняя Мембрана E. coli содержит порины, проницаемые для фосфорилированных соединений, внутренняя мембрана - нет. Затем возникает вопрос, как транспортировать такие соединения через внутреннюю мембрану в цитозоль. Конечно, с сильным анионным зарядом фосфатных групп вместе с остальной частью соединения они очень не смешиваются в неполярной области бислоя. Решение возникает при отщеплении фосфатной группы от соединения посредством ALP. Фактически, вместе с сопутствующим соединением, с которым был связан фосфат, этот фермент дает чистый неорганический фосфат, который в конечном итоге может быть нацелен (система Pst) для перемещения в цитозоль. Таким образом, основной целью дефосфорилирования щелочной фосфатазой является увеличение скорости диффузии молекул в клетки и ингибирование их диффузии наружу.
Щелочная фосфатаза представляет собой цинкосодержащий димерный фермент с молекулярной массой: 86000 Да, каждая субъединица содержит 429 аминокислот с четырьмя остатками цистеина, связывающими две субъединицы. Щелочная фосфатаза содержит четыре иона Zn и два иона Mg, причем Zn занимает активные центры A и B, а Mg - сайт C, поэтому полностью активная природная щелочная фосфатаза называется ферментом (Zn AZnBMgC)2. Механизм действия щелочного фосфатаза включает геометрическую координацию субстрата между ионами Zn в активных центрах, тогда как сайт Mg, по-видимому, не находится достаточно близко, чтобы напрямую участвовать в механизме гидролиза, однако он может вносить вклад в форму электростатического потенциала вокруг Активный центр. Щелочная фосфатаза имеет Km 8,4 x 10.
Щелочная фосфатаза в E. coli редко растворима и активна в условиях повышенных температур, таких как 80 ° C. Из-за кинетической энергии, индуцированной этой температурой слабые водородные связи и гидрофобные взаимодействия обычных белков разрушаются и, следовательно, сливаются и выпадают в осадок. Однако при димеризации ALP связи, поддерживающие его вторичную и третичную структуры, становятся e Они должны быть захоронены таким образом, чтобы не подвергаться такому воздействию при этой температуре. Более того, даже при более высоких температурах, таких как 90 ° C, ALP имеет необычную характеристику обратной денатурации. Благодаря этому, в то время как ALP в конечном итоге денатурирует примерно при 90 ° C, он обладает дополнительной способностью точно реформировать свои связи. и вернуться к своей исходной структуре и функции после охлаждения.
Щелочная фосфатаза в E. coli находится в периплазматическом пространстве и, таким образом, может высвобождаться с использованием методов, которые ослабляют клеточную стенку и высвобождают белок. Из-за расположения фермента и белковой структуры фермента, фермент находится в растворе с меньшим количеством белков, чем в другой части клетки. Тепловая стабильность белков также может быть использована при выделении этого фермента (посредством тепловой денатурации). Кроме того, щелочная фосфатаза может быть проанализирована с использованием п-нитрофенилфосфата. Реакция, при которой щелочная фосфатаза дефосфорилирует неспецифический субстрат, п-нитрофенилфосфат, с образованием п-нитрофенола (PNP) и неорганического фосфата. Желтый цвет PNP и его λ max при 410 позволяют спектрофотометрии определять важную информацию о ферментативной активности. Некоторые сложности бактериальной регуляции и метаболизма предполагают, что другие, более тонкие, цели фермента также могут играть роль для клетки. В лаборатории, однако, мутант Escherichia coli, лишенный щелочной фосфатазы, выживают довольно хорошо, как и мутанты, неспособные остановить выработку щелочной фосфатазы.
Оптимальный pH для активность фермента E. coli составляет 8,0, тогда как оптимальное значение pH фермента крупного рогатого скота немного выше и составляет 8,5. На щелочную фосфатазу приходится 6% всех белков в дерепрессированных клетках.
Когда несколько копий полипептида, кодируемого геном, образуют агрегат, эта структура белка называется мультимером. Когда мультимер формируется из полипептидов, продуцируемых двумя разными мутантными аллелями конкретного гена, смешанный мультимер может проявлять большую функциональную активность, чем несмешанные мультимеры, образованные каждым из мутантов по отдельности. В таком случае явление упоминается как внутригенная комплементация. Щелочная фосфатаза E. coli, димерный фермент, проявляет внутригенную комплементацию. Когда были объединены определенные мутантные версии щелочной фосфатазы, гетеродимерные ферменты, образованные в результате, проявляли более высокий уровень активности, чем можно было бы ожидать, исходя из относительной активности исходных ферментов. Эти результаты показали, что димерная структура щелочной фосфатазы E.coli допускает кооперативные взаимодействия между составляющими мономерами, которые могут генерировать более функциональную форму холофермента.
Изменяя аминокислоты фермента щелочной фосфатазы дикого типа, продуцируемого Escherichia coli, создается мутантная щелочная фосфатаза, уровень фермента которой увеличивается не только в 36 раз. активность, но также сохраняет термостабильность. Типичное применение щелочных фосфатаз в лаборатории включает удаление сложных моноэфиров фосфата для предотвращения самолигирования, что нежелательно при клонировании плазмидной ДНК.
Общие щелочные фосфатазы, используемые в исследованиях, включают:
АЛФаза кишечника человека демонстрирует около 80% гомологии с АЛФазой кишечника крупного рогатого скота, что подтверждает их общее эволюционное происхождение. Тот же самый бычий фермент более чем на 70% гомологичен человеческому плацентарному ферменту. Однако кишечные ферменты человека и плацентарные ферменты имеют только 20% гомологии, несмотря на их структурное сходство.
Щелочная фосфатаза стала полезным инструментом в лабораториях молекулярной биологии, поскольку ДНК обычно содержит фосфатные группы на 5 ' конце. Удаление этих фосфатов предотвращает лигирование ДНК (5 'конец, прикрепленный к 3' концу), таким образом, молекулы ДНК остаются линейными до следующего этапа процесса, для которого они подготовлен; кроме того, удаление фосфатных групп позволяет маркировать радиоактивной меткой (заменой радиоактивными фосфатными группами) для измерения присутствия меченой ДНК на дальнейших этапах процесса или эксперимента. Для этих целей наиболее полезна щелочная фосфатаза креветок, поскольку ее легче всего деактивировать, как только она сделает свою работу.
Еще одно важное применение щелочной фосфатазы - это метка для иммуноферментных анализов.
Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки имеют повышенные уровни щелочной фосфатазы на их клеточной мембране, поэтому используется для обнаружения этих клеток и тестирования плюрипотентности (т.е. эмбриональные стволовые клетки или клетки эмбриональной карциномы ).
Существует положительная корреляция между сывороткой Уровни костной щелочной фосфатазы (B-ALP) и формирование костей у людей, хотя ее использование в качестве биомаркера в клинической практике не рекомендуется.
Текущие исследователи изучают увеличение фактора некроза опухоли-α и его прямое влияние на экспрессию щелочной фосфатазы в гладкомышечных клетках сосудов, а также то, как щелочная фосфатаза (ЩФ) влияет на воспалительные реакции и может играть прямую роль в предотвращении повреждения органов.
Обычно используется щелочная фосфатаза в молочной промышленности как показатель успешной пастеризации. Это связано с тем, что наиболее термостойкие бактерии, обнаруженные в молоке, Mycobacterium paratuberculosis, разрушаются при температурах более низких, чем те, которые необходимы для денатурации ЩФ. Следовательно, присутствие ALP идеально подходит для индикации неудачной пастеризации.
Проверка пастеризации обычно выполняется путем измерения флуоресценции раствора, который становится флуоресцентным при воздействии активной ALP. Производители молока в Великобритании требуют проведения флуориметрических анализов, чтобы доказать, что щелочная фосфатаза денатурирована, поскольку тесты на р-нитрофенилфосфат не считаются достаточно точными, чтобы соответствовать санитарным стандартам.
В качестве альтернативы можно использовать изменение цвета субстрата пара-нитрофенилфосфат в буферном растворе (тест Ашаффенбурга-Маллена). Сырое молоко обычно приобретает желтый цвет в течение нескольких минут, тогда как правильно пастеризованное молоко не должно иметь изменений. Есть исключения из этого, как в случае термостойких щелочных фосфатаз, продуцируемых некоторыми бактериями, но эти бактерии не должны присутствовать в молоке.
Все изоферменты щелочной фосфатазы млекопитающих, кроме плацентарных (PALP и SEAP), ингибируются, и аналогичным образом блокируются все, кроме кишечных и плацентарных. левамизолом. Фосфат является другим ингибитором, который конкурентно ингибирует щелочную фосфатазу.
Другим известным примером ингибитора щелочной фосфатазы является [(4-нитрофенил) метил] фосфоновая кислота.
В почве, загрязненной металлами, щелочная фосфатаза ингибируется Cd (кадмием). Кроме того, температура увеличивает ингибирование активности Cd на активность ЩФ, что проявляется в увеличивающихся значениях Km.
У людей присутствует щелочная фосфатаза во всех тканях по всему телу, но особенно сконцентрирован в печени, желчном протоке, почке, кости, кишечнике слизистая оболочка и плацента. В сыворотке преобладают два типа изоферментов щелочной фосфатазы : скелетные и печеночные. В детстве большая часть щелочной фосфатазы имеет скелетное происхождение. Человек и большинство других млекопитающих содержат следующие изоферменты щелочной фосфатазы:
Четыре гена кодируют четыре изофермента. Ген тканевой неспецифической щелочной фосфатазы расположен на хромосоме 1, а гены трех других изоформ - на хромосоме 2.
Щелочная кишка фосфатаза секретируется энтероцитами и, по-видимому, играет ключевую роль в гомеостазе и защите кишечника, а также в опосредовании воспаления посредством репрессии нижележащего Toll-подобного рецептора (TLR) -4-зависимого и MyD88- зависимый воспалительный каскад. Он дефосфорилирует токсичные / воспалительные микробные лиганды, такие как липополисахариды, неметилированные цитозин-гуаниндинуклеотиды, флагеллин и внеклеточные нуклеотиды, такие как уридиндифосфат или АТФ. Таким образом, измененная экспрессия IAP вовлечена в хронические воспалительные заболевания, такие как воспалительное заболевание кишечника (IBD). Он также, по-видимому, регулирует всасывание липидов и секрецию бикарбонатов в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки, что регулирует поверхностный pH.
Исследования показывают, что белок щелочной фосфатазы, обнаруженный в раковых клетках, аналогичен белку, обнаруженному в незлокачественных тканях организма, и что белок происходит из одного и того же гена в обоих. В одном исследовании сравнивали ферменты метастазов в печень гигантоклеточной карциномы легкого и незлокачественных клеток плаценты. Они были похожи по NH 2 -концевой последовательности, пептидной карте, молекулярной массе субъединицы и изоэлектронной точке.
В другом исследовании, в котором ученые изучали присутствие белка щелочной фосфатазы в толстой кишке человека линия раковых клеток, также известная как HT-29, показала, что активность фермента аналогична активности незлокачественного кишечника. Однако это исследование показало, что без влияния бутирата натрия активность щелочной фосфатазы в раковых клетках довольно низкая. Исследование, основанное на воздействии бутирата натрия на раковые клетки, показывает, что он влияет на экспрессию ко-регулятора рецептора андрогена, активность транскрипции, а также на ацетилирование гистонов в раковых клетках. Это объясняет, почему добавление бутирата натрия показывает повышенную активность щелочной фосфатазы в раковых клетках толстой кишки человека. Кроме того, это еще раз подтверждает теорию о том, что активность фермента щелочной фосфатазы действительно присутствует в раковых клетках.
В другом исследовании клетки хориокарциномы выращивали в присутствии 5-бром-2’-дезоксиуридина (BrdUrd), и результаты показали 30-40-кратное увеличение активности щелочной фосфатазы. Эта процедура повышения активности фермента известна как индукция фермента. Фактические данные показывают, что активность щелочной фосфатазы в опухолевых клетках действительно существует, но она минимальна и требует повышения. Результаты этого исследования также показывают, что активность этого фермента различается в зависимости от клеточных линий хориокарциномы и что активность белка щелочной фосфатазы в этих клетках ниже, чем в незлокачественных клетках плаценты. но уровни значительно выше у детей и беременных женщин. Анализы крови всегда следует интерпретировать с использованием эталонного диапазона из лаборатории, проводившей анализ. Высокий уровень ЩФ может возникать, если желчные протоки заблокированы.
Кроме того, ЩФ увеличивается, если происходит активное костеобразование, поскольку ЩФ является побочным продуктом активности остеобластов (например, костная болезнь Педжета ).
ЩФ гораздо больше повышена в метастатических клетках рака простаты, чем в клетках неметастатического рака простаты. Высокие уровни ЩФ у пациентов с раком простаты связаны со значительным снижением выживаемости.
Уровни также повышены у людей с нелеченой глютеновой болезнью. Пониженные уровни ЩФ встречаются реже, чем повышенные. Источник повышенных уровней ЩФ может быть определен путем определения сывороточных уровней гамма-глутамилтрансферазы (GGT). Сопутствующее повышение ЩФ с GGT должно вызвать подозрение на гепатобилиарное заболевание.
Некоторые заболевания не влияют на уровень щелочной фосфатазы, например, гепатит С. Высокий уровень этого фермента влияет на уровень щелочной фосфатазы. не отражают какого-либо повреждения печени, даже если высокий уровень щелочной фосфатазы может быть результатом блокирования кровотока в желчных путях или повышения давления в печени.
Если неясно, почему уровень щелочной фосфатазы повышен, исследования изофермента с использованием электрофореза могут подтвердить источник ЩФ. Скельфосфатаза (которая локализуется в остеобластах и внеклеточных слоях вновь синтезированного матрикса) попадает в кровоток по еще неясному механизму. Уровень щелочной фосфатазы в плаценте повышен при семиномах и активных формах рахита, а также при следующих заболеваниях и состояниях:
Следующие состояния или заболевания могут привести к снижению уровня щелочной фосфатазы:
Кроме того, было доказано, что оральные контрацептивы снижают щелочную фосфатазу.
Измерение щелочной фосфатазы ( вместе с простатоспецифическим антигеном) во время и после шести месяцев лечения метастатическим раком простаты гормональной терапией прогнозирует выживаемость пациентов.
Обнаружена лейкоцитарная щелочная фосфатаза (LAP) внутри зрелых белых кровяных телец. Уровни лейкоцитов LAP могут помочь в диагностике определенных состояний.
Щелочная фосфатаза является гомодимерным ферментом, что означает состоит из двух молекул. Три иона металла, два Zn и один Mg, содержатся в каталитических центрах, и оба типа имеют решающее значение для возникновения ферментативной активности. Ферменты катализируют гидролиз сложных моноэфиров в фосфорной кислоте, которая может дополнительно катализировать реакцию трансфосфорилирования с большими концентрациями акцепторов фосфата. В то время как основные черты каталитического механизма и активности сохраняются между щелочным фосфатом млекопитающих и бактерий, щелочная фосфатаза млекопитающих имеет более высокую удельную активность и значения K m, таким образом, более низкое сродство, более щелочной оптимум pH, более низкая термостойкость., и обычно связаны с мембраной и ингибируются l-аминокислотами и пептидами посредством неконкурентного механизма. Эти свойства заметно различаются между различными изоферментами щелочной фосфатазы млекопитающих и, следовательно, демонстрируют различие в функциях in vivo.
Щелочная фосфатаза гомологична большому количеству других ферментов и составляет часть суперсемейства ферментов с несколькими перекрывающимися каталитическими аспектами и характеристиками субстрата. Это объясняет, почему наиболее заметные структурные особенности щелочных веществ у млекопитающих являются такими, какие они есть, и отсылают их субстратную специфичность и гомологию к другим членам семейства изоферментов нуклеозидпирофосфатазы / фосфодиэстеразы. Исследования показали связь между членами семейства щелочной фосфатазы и арилсульфатазами. Сходство в структуре указывает на то, что эти два семейства ферментов произошли от общего предка. Дальнейший анализ связал щелочные фосфаты и арилсульфатазы с более крупным суперсемейством. Некоторые из общих генов этого суперсемейства кодируют как фосфодиэстеразы, так и аутотоксин.
