Трансформация (генетика)

редактировать
На этом изображении ген из бактериальной клетки перемещается из бактериальной клетки 1 в бактериальную клетку 2. Этот процесс бактериальной блокировки 2 нового генетического материала называется трансформацией.

В молекулярной биологии и генетике, трансформация - это генетическое изменение клетка, полученная в результате прямого усиление и включение экзогенного генетического материала из окружающей среды через клеточную мембрану (ы). Чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии компетентности, что может иметь место в природе как ограниченная по времени реакция на условия окружающей среды, такие как голодание и плотность клеток, а также может быть индуцировано в лаборатория.

Трансформация - это один из трех процессов горизонтального переноса генов, в котором экзогенный генетический материал переходит от одной бактерии к другому, и два других являются конъюгацией (перенос генетического материала двумя бактериофагами в прямом контакте) и трансдукция (инъекция чужеродной ДНК вирусом бактериофага в бактерию-хозяин). При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.

По состоянию на 2014 год известно, что около 80 видов бактерий способны к трансформации, примерно поровну разделенных между Грамположительные и грамотрицательные бактерии ; это число может быть завышенным, поскольку некоторые из документов подтверждаются статьями.

«Трансформация» также инет введение введения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку «трансформация » имеет особое значение по отношению к животным клеткам, процесс прогрессирования до ракового состояния обычно называется «трансфекция ".

Содержание

  • 1 История
  • 2 Определения
  • 3 Естественная компетентность и трансформация
    • 3.1 Естественная трансформация
    • 3.2 Трансформация как адаптация к репарации ДНК
  • 4 Методы и механизмы трансформации в лаборатории
    • 4.1 Бактериальные
    • 4.2 Дрожжи
    • 4.3 Растения
    • 4.4 Грибы
    • 4.5 Животные
  • 5 Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии
    • 5.1 Отбор и скрининг при трансформации плазмид
  • 6 Ссылки
  • 7 Внешние ссылки

История

Трансформация бактерий была введена в 1928 году британским бактериологом Фредериком Гриффитом. Гриффит интересовался вопросом, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей от пневмонии., он обнаружил, что невирулентный штамм Streptococcu s pneumoniae могла стать вирулентной после воздействия убитых нагреванием вирулентных штаммов. Гриффит предположил, что некий "принцип трансформации " убитого нагревания штамма был ответственен за то, что безвредный штамм стал вирулентным. В 1944 году Освальд Эйвери, Колин МакЛауд и Маклин МакКарти идентифицировали этот «трансформирующий принцип» как генетический. Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и, используя именно эту ДНК, смогли сделать безвредный штамм вирулентным. Они назвали это поглощение и включение ДНК бактериями «трансформацией» (см. эксперимент Эйвери-МакЛеода-Маккарти ). Результаты экспериментов Эйвери и др. Сначала были скептически созданы научным сообществом, и это было только после разработки генетических маркеров и открытия других методов генетического переноса (конъюгация в 1947 году и трансдукция в 1953 году) Джошуа Ледерберг, что эксперименты Эйвери были приняты.

Первоначально считалось, что Escherichia coli, широко лабораторный организм, невосприимчив к трансформации. В 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что E. coli может потреблять поглощение ДНК от бактериофага λ без использования после обработки раствором хлорида кальция. Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн, Энни Чанг и Лесли Хсу показали, что обработка CaCl. 2также эффективна для трансформации плазмидной ДНК. Метод трансформации Манделя и Хиги позже был усовершенствован Дугласом Ханаханом. Обнаружение искусственно индуцированной способности у E. coli создало эффективную и удобную трансформацию бактерий, которая позволяет использовать более простые методы молекулярного клонирования в биотехнологии и исследованиях, а также в настоящее время это обычная лабораторная процедура.

Трансформация с использованием электропорации бюджет в конце 1980-х годов, увеличивая эффективность трансформации in vitro и увеличивая количество бактериальных штаммов, которые могут быть трансформированы. Трансформация клеток животных и растений была исследована с первой трансгенной мышью, произведенной путем инъекции гена гормона роста крыс в эмбрион мыши в 1982 году. В 1907 году бактерия, вызвавшая опухоли растений, была открыта Agrobacterium tumefaciens, и в начале 1970-х годов было обнаружено индуцирующий опухоль агент представляет собой ДНК плазмиду, названную плазмидой Ti. Удалив в плазмиде гены, вызвавшие опухоль, и добавившие новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и ученые бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений. Не все растительные клетки восприимчивы к инфекции A. tumefaciens, поэтому были разработаны другие методы, включая электропорацию и микроинъекцию. Бомбардировка частицами стала возможной с изобретением системы доставки биологических частиц (генная пушка) Джоном Сэнфордом в 1980-х.

Определения

Трансформация - это одна из трех форм горизонтального переноса генов, которые встречаются в природе среди бактерий, при которых ДНК, кодирующий признак, передается от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента посредством гомологичной рекомбинации ; два других - это трансдукция, осуществляемая с помощью бактериофага, и конъюгация, при которой ген передается посредством прямого контакта между бактериями. При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.

Компетенция относится к временному состоянию, когда он поглощает экзогенную ДНК из окружающей среды; его можно вызвать в лаборатории.

Похоже, что это древний процесс, унаследованный от общего прокариотического предка, который является рекомбинационной репарацией повреждений ДНК, особенно повреждений, приобретенных в стрессовых условиях. Естественная генетическая трансформация, по-видимому, является адаптацией к восстановлению повреждений ДНК, которая также генерирует генетическое разнообразие.

Трансформация была изучена у важных с медицинской точки зрения грамотрицательных бактерий видов, таких как Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae и Vibrio cholerae. Он также был изучен на грамотрицательных, обнаруженных в почве, таких как Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, и грамотрицательных патогенах растений, таких как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa. Трансформация среди грамположительных бактерий была изучена у важных с медицинской точки зрения видов таких как Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus и Streptococcus sanguinis и в грамположительной почвенной бактерии Bacillus subtilis. Об этом также сообщалось по меньшей мере у 30 видов Протеобактерии, распределенных по классам альфа, бета, гамма и эпсилон. Наиболее изученными протеобактериями в отношении трансформации важных с медицинской точки зрения патогены человека Neisseria gonorrhoeae (класс бета), Haemophilus influenzae (класс гамма) и Helicobacter pylori (класс эпсилон)

«Трансформация» местная иноверция для внедрения нового введения материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку «трансформация » имеет особое значение по отношению к животным клеткам, указывающее на прогрессирование до ракового состояния, этот процесс обычно называется «трансфекция ".

Естественная компетентность и трансформация

По состоянию на 2014 год известно около 80 видов бактерий, способных к трансформации, примерно поровну разделенных между грамположительными и грамотрицательными бактериями ; это число может быть завышенным, поскольку несколько подкреплены отдельными статьями.

Естественно компетентные бактерии несут наборы генов, которые обеспечивают белковый для переноса ДНК через клеточную аппаратную мембрану (мембраны). Для транспортировки экзогенной ДНК клетки могут потребоваться белки, которые участвуют в сборке пилей типа IV и системы секреции типа II, а также комплекса ДНК транслоказы на цитоплазматической мембране.

Из-за различий в структуре клеточной оболочки грамположительных и грамположительных бактерий, существуют различные механизмы захвата ДНК в этих клетках, однако большинство из них имеют общие черты, которые связаны с родственными белками. ДНК сначала связывается с поверхностью компетентных клеток на рецепторе ДНК и проходит через цитоплазматическую мембрану через ДНК-транслоказу. Может проходить только одноцепочечная ДНК, при этой другой цепи разрушается нуклеазами. Затем транслоцированная одноцепочечная ДНК интегрирована в бактериальные хромосомы с помощью RecA -зависимого процесса. В грамотрицательных клетках из-за наличия дополнительной мембраны ДНК требуется канал образованного секретинами на внешней мембране. Пилин может потребоваться для компетентности, но его роль неясна. Поглощение обычно неспецифично для последовательности, хотя у некоторых видов специфических последовательностей захвата ДНК может эффективному захвату ДНК.

Естественная трансформация

Естественная трансформация - это бактериальная адаптация ДНК передача, которая зависит от экспрессии бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, ответственны за этот процесс. В целом трансформация - сложный, энергоемкий процесс развития. Чтобы бактерия могла связывать, захватывать и рекомбинировать экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна стать компетентной, чтобы есть войти в особое физиологическое состояние. Развитие компетенции в Bacillus subtilis требует экспрессии около 40 генов. ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но за редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и таким образом, гомологична резидентной хромосоме.

У B. subtilis перенесенная длина ДНК превышает 1271 т.п.н. (более 1 миллиона оснований). Переносимая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети общей длины хромосомы в 4215 т.п.н. Похоже, что около 7-9% реципиентных клеток занимают всю хромосому.

Способность к естественной трансформации проявляется у ряда прокариот, и на данный момент известно 67 видов прокариот (в семи различных типах).

Компетенция к трансформации обычно индуцирует высокой плотностью клеток и / или ограничением питания, связанными с стационарной фазой роста бактерий. Трансформация Haemophilus influenzae наиболее эффективно происходит в конце экспоненциального роста, когда рост бактерий приближается к стационарной фазе. Трансформация Streptococcus mutans, а также многих других стрептококков происходит при высокой плотности клеток и связях с образованием биопленки. Компетентность B. subtilis индуцируется к концу логарифмического роста, особенно в условиях ограничения аминокислот. Точно так же у Micrococcus luteus (представитель менее изученного типа Actinobacteria ) компетентность развивается во время средне-поздней фазы экспоненциального роста и также запускается из-за нехватки аминокислот.

Высвобождая интактную ДНК хозяина и плазмидную ДНК, некоторые бактериофаги, как полагают, вносят вклад в трансформацию.

Трансформация как адаптация к репарации ДНК

индуцирует повреждения ДНК. Например, в Streptococcus pneumoniae трансформация индуцируемых повреждающими ДНК агентами митомицином С (агент, сшивающий ДНК) и фторхинолоном (ингибитор топоизомеразы, вызывающий двухцепочечные разрывы). У B. subtilis трансформация усиливается УФ-светом, агентом, повреждающим ДНК. У Helicobacter pylori ципрофлоксацин, который взаимодействует с ДНК-гиразой и вводит двухцепочечные разрывы, индуцирует экспрессию генов компетентности, тем самым увеличивая частоту трансформации с использованием Legionella pneumophila, Charpentier et al. протестировали 64 токсичных молекулы, чтобы определить, какие из них вызывают компетентность. Из них только шесть агентов, повреждающих ДНК, вызывающих сильную индукцию. Этими агентами, повреждающими ДНК, были митомицин С (который вызывает межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксовая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие двухцепочечные разрывы), бицикломицин (вызывающие одно- и двухцепочечные разрывы) и гидроксимочевина. (вызывает окисление оснований ДНК). Ультрафиолетовый свет также стимулировал компетентность L. pneumophila. Charpentier et al. предположили, что способность к трансформации, вероятно, возникла реакция на повреждение ДНК.

Логарифмически растущие бактерии обладают способностью выполнять важный процесс репарации ДНК, вызываемые копий генома, присутствующие в клетке, и это влияет на способность выполнять важный процесс. Хромосомы бактериального роста в бактериальной клетке. Процесс гомологичной рекомбинационной репарации (HRR) - это ключевой процесс репарации ДНК, который эффективен для восстановления двухцепочечных повреждений, как двухцепочечные разрывы. Этот процесс зависит от второй гомологичной хромосомы в дополнение к поврежденной хромосоме. Во время последовательного роста ДНК в одной хромосоме может быть восстановлено с помощью HRR с использованием логической последовательности другой гомологичной хромосомы. Однако, когда клетки приближаются к стационарной фазе, они обычно имеют только одну копию хромосомы, и HRR требует ввода гомологичной матрицы извне путем трансформации.

Чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации репарацией ДНК. повреждений, была проведена серия экспериментов с использованием B. subtilis, облученного УФ-светом, в качестве повреждающего агента (обзор Michod et al. и Bernstein et al.). Результаты этих экспериментов показали, что трансформация ДНК работает для здоровых летальных повреждений ДНК. вводится ультрафиолетовым светом в ДНК реципиента. Конкретный процесс, ответственный за ремонт, вероятно, был HRR. Трансформация у бактерий может рассматриваться как примитивный половой процесс, поскольку он включает взаимодействие гомологичной ДНК двух индивидуумов с образованием рекомбинантной ДНК, передается последующим поколениям. Бактериальная трансформация прокариот, возможно, была наследственным процессом, который привел к мейотическому половому размножению у эукариот (см. Эволюция полового размножения ; Мейоз.)

Методы и механизмы трансформации в лаборатории

Схема бактериальной трансформации - для которой сначала должна быть вызвана искусственная компетентность.

Бактериальная

Искусственная компетентность может быть вызвана в лабораторных процедурах, которые включают в себя создание пассивной проницаемости клетки для ДНК путем воздействия в условиях, которые обычно не встречаются в природе. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащие двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ), в холодных условиях перед воздействием теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяин. Клетки, способные принимать ДНК, называются компетентными клетками.

Было обнаружено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ снижает количество связей белок- липополисахарид за счет увеличения ионных и ковалентных связей, что увеличивает мембрану текучесть, облегчая трансформацию. Более короткие O-боковые цепи трансформируются более - возможно, из-за улучшенной доступности ДНК.

Поверхность бактерий, таких как E. coli, заряжена отрицательно из-за фосфолипидов и липополисахаридов на ее клеточной поверхности, а ДНК также заряжена отрицательно. Таким образом, одна из функций двухвалентного катиона - защищать заряды путем координации фосфатных групп и других отрицательных зарядов, тем самым позволяя молекуле ДНК прикрепляться к поверхности клетки.

Вход ДНК в клетки E. coli осуществляется через каналы, известные как зоны адгезии или соединения Байера, при этом типичная клетка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда было обнаружено, что кобаламин (который также использует эти каналы) конкурентно ингибирует захват ДНК. Другой тип канала, участвующего в захвате ДНК, состоит из поли (HB): поли P: Ca. В этом случае предполагается, что поли (HB) оборачивается вокруг ДНК (сам по себе полифосфат) и переносится в щит, образованный ионами Са.

Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодных условиях также может изменить или ослабить структуру поверхности клетки, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс на клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.

Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергают воздействию электрического поля 10-20 кВ / см, которое, как считается, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникать плазмидная ДНК. После электрического шока отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембраны клетки.

Дрожжи

Большинство видов дрожжей, включая Saccharomyces cerevisiae, могут трансформироваться экзогенной ДНК в окружающей среде. Было разработано несколько методов для облегчения этой трансформации с высокой частотой в лаборатории.

  • Дрожжевые клетки можно обрабатывать ферментами для разрушения их клеточных стенок, в результате чего получают сферопласты. Эти клетки очень хрупкие, но с высокой скоростью поглощают чужеродную ДНК.
  • Воздействие на интактные дрожжевые клетки щелочных катионов, например, цезия или литий позволяет клеткам захватывать плазмидную ДНК. Более поздние протоколы адаптировали этот метод трансформации с использованием ацетата лития, полиэтиленгликоля и одноцепочечной ДНК. В этих протоколах одноцепочечная ДНК предпочтительно связывается со стенкой дрожжевых клеток, предотвращая это от плазмидной ДНК и оставляя ее доступной для трансформации.
  • Электропорация : образование временных отверстий в клеточных мембранах с помощью электрического шока; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.
  • Ферментативное расщепление или перемешивание стеклянными шариками также можно использовать для трансформации дрожжевых клеток.

Эффективность - Различные роды и виды дрожжей поглощают чужеродную ДНК с разной эффективностью. Кроме того, большинство протоколов трансформации было разработано для пекарских дрожжей S. cerevisiae, и поэтому они могут быть неоптимальными для другихвидов Даже внутри одного вида разные штаммы обладают разной эффективностью трансформации. Например, когда штаммы S. cerevisiae трансформировали 10 мкг плазмиды YEp13, штамм DKD-5D-H давал от 550 до 3115 колоний, тогда как штамм OS1 давал менее пяти колоний.

Растения

Существует ряд методов переноса ДНК в клетки растений. Некоторые методы, опосредованные вектором :

  • Трансформация, опосредованная Agrobacterium, представляет собой наиболее легкую и простую трансформацию растений. Ткань растений (часто листья) разрезают на мелкие кусочки, например 10х10 мм и вымачивают десять минут в жидкости, суспендированные агробактерии. Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным при разрезе. Клетки растений выделяют связанные с раной фенольные соединения, которые, в свою очередь, активизируют оперон вирулентности Agrobacterium. Оперон вирулентности включает в себя набор генов, которые кодируют белки, которые являются частью системы секреции типа IV, которая экспортируется из бактериальных белков и ДНК (обозначенных специфическими мотивами распознавания, называемых пограничными последовательностями). клетка через структуру, называемую пилусом. Перенесенная ДНК (называемая Т-ДНК) направляется в ядро ​​растительной клетки с помощью ядерной локализации, присутствующих в белке VirD2 Agrobacterium, которая ковалентно прикреплен к концу Т-ДНК на правой границе (RB). То, как именно Т-ДНК интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина, активна активная область исследования биологии растений. Предполагаемая, что маркер селекции (такой как ген устойчивости к антибиотикам) был включен в Т-ДНК, трансформированную ткань можно культивировать в селективных средах для получения побегов. Затемеги переносят в другую среду, формированию корней. Как только корни трансгенного побега начинают прорастать, растения можно переносить в почву для завершения нормального жизненного цикла (семян). Семена этого первого растения (называемого Т1, для первого трансгенного поколения). типа. Некоторые виды растений, такие как Arabidopsis thaliana, можно трансформировать путем погружения цветов или всего растения в суспензию Agrobacterium tumefaciens, обычно штамма C58 (C = Cherry, 58 = 1958, год, в котором конкретный штамм A. tumefaciens был выращен. Изолирован от вишневого). дерева в саду Корнельского университета в Итаке, Нью-Йорк). Несмотря на то, что растения остаются невосприимчивыми к трансформации этим методом, продолжаются исследования.
  • Вирусная трансформация (трансдукция ): Упакуйте желаемый генетический материал в подходящий растительный вирус и позвольте этому модифицированному вирусу заразить растение. Он может рекомбинировать хромосомами с образованием трансформантных клеток. Однако геномы вирусов растений состоят из одноцепочечной РНК, которая реплицируется в цитоплазме инфицированной клетки. Для таких геномов этот метод является способом трансфекции, а не реальной трансформацией, встроенными гены никогда не достигают ядра клетки и не интегрируются в геном хозяина. Потомство инфицированных растений не содержит вирусов и встроенного гена.

Некоторые безвекторные методы включают:

  • Генная пушка : также называется бомбардировкой частицами, бомбардировкой микрочастицами или биолистикой. Частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем проникают в клетки растений или зародыши растений. Некоторый генетический материал останется в клетках и трансформирует их. Этот метод также позволяет трансформировать пластиды растений. Эффективность трансформации ниже, чем при трансформации, опосредованной Agrobacterium, но с помощью этого метода можно трансформировать большинство растений.
  • Электропорация : образование временных отверстий в клеточных мембранах с использованием импульсов высокой напряженности поля. ; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий.

Грибы

Существуют некоторые методы приема трансгенных грибов, большинство из других методов которых используются тем, которые используются для растений. Однако к грибам нужно относиться по-разному из-за некоторых их микроскопических и биохимических функций:

  • Основная проблема дикариотическое состояние, в которых находятся части некоторых грибов; дикариотические клетки содержат два гаплоидных ядра, по одному от родительского гриба. Стенки грибковых клеток довольно толстые, что препятствует захвату ДНК, поэтому часто требуется (частичное) удаление, если трансформируется только одно из них, что является правилом, процент трансформированных ядер уменьшается после каждой споруляции.
  • . полная деградация, которая иногда необходима, дает протопласты.
  • Мицелиальные грибы, состоящие из нитевидных гиф, если вообще, разделены внутренними клеточными стенками, прерванными порами, достаточно большими для обеспечения питательных веществ и органеллы, иногда даже ядра, проходят через каждую гифу. В результате клетки обычно не могут быть разделены. Это проблематично, поскольку соседние трансформированные клетки могут сделать нетрансформированные клетки невосприимчивыми к селективным обработкам, например, путем доставки питательных веществ или белков для обеспечения устойчивости к антибиотикам.
  • Кроме того, рост (и, следовательно, митоз) этих грибов происходит исключительно на кончике их гиф, что также может вызывать проблемы.

Как указывалось ранее множество грибков методов, используемых для трансформации растений, также работают с грибами:

  • Agrobacterium способна заражать не только растения, но и грибы, однако, в отличие от растений, грибы не выделяют фенольные соединения, необходимые для запуск Agrobacterium, поэтому их нужно добавить, например в форме ацетосирингона.
  • . Благодаря развитию системы экспрессии малых РНК в грибах стало возможным введение в грибковые клетки. В 2016 году Министерство сельского хозяйства США разработало, что не будет регулировать штамм белого шампиньона, отредактированный с помощью CRISPR / CAS9, чтобы предотвратить потемнение плодовых тел, вызвав широкую дискуссию о размещении на рынке культур с редактированием CRISPR / CAS9.
  • Физические методы, такие как электропорация, биолистика («генная пушка»), сонопорация, которая используется кавитация пузырьков газа, производимых ультразвуком для проникновения через клеточную мембрану, и т. д. также применимы к грибам.

Животные

Введение ДНК в клетки животных обычно называют трансфекцией, и это обсуждается в форме статьи.

Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии

Открытие искусственно индуцированной компетентности у бактерий позволяет использовать такие бактерии, как Escherichia coli, в качестве удобного хозяина для манипулирования ДНК, а также экспрессирующих белки. Обычно плазмиды используются для трансформации E. coli. Чтобы стабильно сохраняться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать точку начала репликации, которая позволяет ей реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки.

Эффективность, с которой компетентная культура может поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, известна как эффективность трансформации и измеряется в колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг используемой ДНК. Эффективность трансформации 1 × 10 КОЕ / г для небольшой плазмиды, такой как pUC19, примерно эквивалентна 1 на 2000 молекулы трансформируемой плазмиды.

В трансформация хлористым кальцием происходит через клетки охлаждения в клетках Ca. (в растворе CaCl. 2 ), в результате чего клетка становится проницаемой для плазмидная ДНК. Клетки инкубируют на льду с ДНК, подвергают подвернувшемуся короткому тепловому шоку (например, при 42 ° C в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать от 10 до 10 трансформантов на микрограмм плазмиды; плохой препарат будет примерно 10 / мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~ 10 колоний на микрограмм плазмиды. Однако существуют протоколы для создания суперкомпетентных клеток, которые могут обеспечить эффективность трансформации более 10. Однако химический метод обычно не работает для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, из-за собственной экзонуклеазы клетки. ферменты быстро разрушают линейную ДНК. Напротив, естественные компетентные клетки обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК.

Эффективность трансформации с использованием метода CaCl. 2Эффективность трансформации с помощью метода захвата плазмиды. Клетки, используемые в электропорации, должны быть сначала промывкой в ​​холодной бидистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые создают искры в процессе электропорации.

Отбор и скрининг при трансформации плазмид

Обычно трансформация CMY дает смесь небольшого числа трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходимый метод отбора клеток, которые приобрели плазмида. Следовательно, для плазмиды требуется селективный маркер, чтобы клетки без плазмиды могли быть убиты или их рост был остановлен. Устойчивость к антибиотикам - часто используется маркер прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику, к которым бактерии в остальном чувствительности. Смесь обработанных клеток культивируют в среде антибиотик, так что только трансформированные клетки могут расти. Другой метод отбора - это использование определенных функций ауксотрофных маркеров, которые могут компенсировать неспособность адаптировать гибридные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования подходящих мутированных штаммов, которые являются недостаточными для синтеза или полезности биомолекулы, и трансформированные клетки культивируются в среде, которая позволяет расти только клеткам, существим плазмиду.

В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таком эксперименте не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Следовательно, могут быть использованы дополнительные методы для скрининга трансформированных клеток, плазмиду со вставкой. Репортерные гены могут быть в качестве маркеров, например, ген lacZ, который кодирует β-галактозидазу, используемую в синем белый экран. Этот метод скрининга основан на принципе α- комплементации, где фрагмент гена lacZ (lacZα) в плазмиде может комплементировать другой мутантный ген lacZ (lacZΔM15) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержит lacZ-α, трансформируется в клетки lacZΔM15, они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить при выращивании клеток в чашках, содержащих X-gal, с образованием характерных синих колоний. Однако сайт множественного клонирования, где представляющий интерес ген может быть лигирован в плазмидный вектор, расположен внутри гена lacZα. Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα, и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, затем можно легко отличить по ее белой окраске от неудачных синих.

Другими часто используемыми репортерными генами являются зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, светящиеся зеленым в синем свете, и фермент люцифераза, который катализирует реакцию с люциферином для излучения света. Рекомбинантная ДНК также может быть обнаружена с использованием других методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с радиоактивным РНК-зондом, в то время как клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, также могут быть обнаружены с использованием иммунологических методов.

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-11 09:48:02
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте