Войти
The Система клонирования шлюза, изобретенная и коммерциализированная Invitrogen с конца 1990-х годов, представляет собой метод молекулярной биологии, который позволяет исследователям эффективно переносить ДНК-фрагменты между плазмидами с использованием запатентованного набора рекомбинационных последовательностей, сайтов "Gateway att" и двух патентованных смесей ферментов, называемых "LR-клоназа" и "BP-клоназа". Методика клонирования шлюза позволяет переносить фрагменты ДНК между различными векторами клонирования, сохраняя при этом рамку считывания. Используя Gateway, можно клонировать сегменты ДНК субклон для функционального анализа. Система требует первоначальной вставки фрагмента ДНК в плазмиду с двумя фланкирующими рекомбинационными последовательностями, называемыми «att L 1» и «att L 2», для создания «входного клона шлюза» (специальная номенклатура Invitrogen).
Большие архивы клонов Gateway Entry, содержащие подавляющее большинство ORF человека, мыши и крысы (открытые рамки считывания ), были клонированы из библиотек кДНК человека или химически синтезированы для поддержки исследовательского сообщества с использованием финансирования NIH (Национальные институты здравоохранения) (например, Коллекция генов млекопитающих, http://mgc.nci.nih.gov/ ). Наличие этих кассет генов в стандартной плазмиде для клонирования Gateway помогает исследователям быстро переводить эти кассеты в плазмиды, которые облегчают анализ функции генов. Клонирование шлюза требует больше времени для начальной настройки и дороже, чем традиционные методы клонирования с помощью рестрикционных ферментов и лигаз, но экономит время и предлагает более простое и высокоэффективное клонирование для последующих приложений.
Технология была широко принята сообществом исследователей биологических наук, особенно для приложений, требующих переноса тысяч фрагментов ДНК в плазмиду одного типа (например, содержащую промотор CMV для экспрессии белка в клетках млекопитающих) или для переноса одного фрагмента ДНК во множество различных типов плазмид (например, для экспрессии белков бактерий, насекомых и млекопитающих).
Первым шагом клонирования шлюза является подготовка клона входа шлюза. Входные клоны часто делаются в два этапа:
1) Последовательности «Gateway attB1 и attB2» добавляются к 5 'и 3' концу фрагмента гена, соответственно, с использованием специфичных для генов праймеров ПЦР и ПЦР -амплификация;
2) затем продукты амплификации ПЦР смешивают со специальными плазмидами, называемыми Gateway «Донорские векторы» (номенклатура Invitrogen), и патентованной смесью ферментов «BP Clonase». Смесь ферментов катализирует рекомбинацию и вставку продукта ПЦР, содержащего att-B-последовательность, в сайты рекомбинации att P в векторе-доноре шлюза. Как только кассета является частью целевой плазмиды, она называется «входной клон» в номенклатуре шлюза, а рекомбинационные последовательности упоминаются как шлюз типа «att L».
Кассета гена в клоне Gateway Entry затем может быть просто и эффективно перенесена в любой вектор-адресат Gateway (номенклатура Invitrogen для любой плазмиды Gateway, которая содержит последовательности рекомбинации Gateway «att R» и такие элементы, как промоторы и теги эпитопа, но не ORF ) с использованием запатентованной ферментной смеси «LR Clonase». Созданы тысячи плазмид Gateway Destination, которые бесплатно распространяются среди исследователей по всему миру. Векторы-адресаты шлюза аналогичны классическим векторам экспрессии, содержащим несколько сайтов клонирования, до вставки представляющего интерес гена с использованием переваривания рестрикционными ферментами и лигирования. Векторы-адресаты шлюза коммерчески доступны от Invitrogen, EMD (Novagen ) и Covalys.
Поскольку при клонировании Gateway используются запатентованные последовательности рекомбинации и патентованные смеси ферментов, доступные только от Invitrogen, эта технология не позволяет исследователям менять поставщиков и способствует эффекту блокировки всех таких запатентованных процедуры.
Подводя итог различным этапам клонирования шлюза:
