Саузерн-блот

редактировать
Агарозный гель Поднос со стопкой, состоящей из гирь сверху вниз, бумажные полотенца, мембрана из нитроцеллюлозы или нейлон, гель, раствор соли и кусок стекла. Мембрана для блоттинга по Саузерну после гибридизации и промывка. Агарозный гель для саузерн-блоттинга при ультрафиолетовом освещении. Саузерн-блот авторадиограмма.

A Саузерн-блот - метод, используемый в молекулярной биологии для обнаружения конкретной последовательности ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг объединяет перенос разделенных электрофорезом фрагментов ДНК на мембрану фильтра и последующее обнаружение фрагментов с помощью гибридизации зонда.

. Метод назван в честь британского биолога. Эдвин Саузерн, который впервые опубликовал его в 1975 году. Другие методы блоттинга (например, вестерн-блот, нозерн-блот, вестерн-блот, юго-западный блот ), в которых используются аналогичные принципы, но с использованием РНК или белка, позже они были названы со ссылкой на имя Эдвина Саузерна. Так как метка одноименного, Southern пишется с заглавной буквы, как это принято для имен собственных. Имена для других методов блоттинга могут соответствовать этому соглашению по аналогии.

Содержание

  • 1 Метод
  • 2 Результат
  • 3 Приложения
  • 4 См. Также
  • 5 Ссылки
  • 6 Внешние ссылки

Метод

  1. Рестрикция эндонуклеазы используются для разрезания высокомолекулярных цепей ДНК на более мелкие фрагменты.
  2. Затем фрагменты ДНК подвергают электрофорезу на агарозный гель для разделения их по размеру.
  3. Если некоторые из фрагментов ДНК имеют размер более 15 т.п.н., то перед блоттингом гель можно обработать кислота, такая как разбавленная HCl. Это депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля на мембрану.
  4. Если используются методы щелочного переноса, гель ДНК помещается в щелочной раствор (обычно содержащий гидроксид натрия ) для денатурирования двухцепочечной ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных остатков тимина ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя их на отдельные цепи ДНК для последующей гибридизации с зондом (см. Ниже) и разрушает любую остаточную РНК, которая все еще может присутствовать в ДНК. Однако выбор щелочного метода переноса вместо нейтрального часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам.
  5. Лист нитроцеллюлозы (или, альтернативно, нейлон ) мембрана помещается поверх (или ниже, в зависимости от направления переноса) геля. Давление прилагается к гелю равномерно (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При всасывании используется буфер 20X SSC для обеспечения герметичности и предотвращения высыхания геля. Перенос буфера посредством капиллярного действия из области с высоким водным потенциалом в область с низким водным потенциалом (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) затем используется для перемещения ДНК из геля на мембрана; ионный обмен взаимодействия связывают ДНК с мембраной из-за отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны.
  6. Затем мембрану запекают в вакууме или обычной печи при 80 ° C в течение 2 часов (стандартные условия; нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или воздействие ультрафиолетового излучения (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
  7. Затем мембрану подвергают воздействию гибридизационный зонд - отдельный фрагмент ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК подлежит определению. ДНК зонда помечена так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивности или метки молекулы флуоресцентным или хромогенным красителем. В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть сделан из РНК, а не из ДНК. Чтобы гарантировать специфичность связывания зонда с образцом ДНК, в наиболее распространенных методах гибридизации используется ДНК спермы лосося или сельди для блокировки поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированный формамид и детергенты, такие как SDS для уменьшения неспецифического связывания зонда.
  8. После гибридизации избыток зонда вымывается с мембраны (обычно с использованием буфера SSC ​​ ), и характер гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке с помощью авторадиографии в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда или по проявлению цвета на мембране, если используется метод хромогенного обнаружения.

Результат

Гибридизация зонда с конкретным фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную зонду. Этап переноса ДНК из геля для электрофореза на мембрану позволяет легко связывать меченый гибридизационный зонд с фракционированной по размеру ДНК. Он также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа с помощью авторадиографии или других методов обнаружения. Саузерн-блоттинг, выполняемый с геномной ДНК, расщепленной рестрикционными ферментами, можно использовать для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геноме. Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестрикционным ферментом, будет давать одну полосу на Саузерн-блоттинге, тогда как несколько полос, вероятно, будут наблюдаться, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, теми, которые может быть результатом дублирования последовательности). Модификация условий гибридизации (например, повышение температуры гибридизации или уменьшение концентрации соли) может использоваться для увеличения специфичности и уменьшения гибридизации зонда с последовательностями, которые менее чем на 100% похожи.

Применения

Перенос саузерн-блоттинга может использоваться для клонирования на основе гомологии на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды сконструированы так, что они подобны целевой последовательности. Олигонуклеотиды химически синтезируются, помечаются радиоактивными метками и используются для скрининга библиотеки ДНК или других коллекций клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с гибридизационным зондом, дополнительно анализируются, например, для получения полной последовательности целевого гена.

Саузерн-блоттинг также можно использовать для идентификации метилированных сайтов в определенных генах. Особенно полезными являются рестрикционные нуклеазы MspI и HpaII, обе из которых распознают и расщепляют одну и ту же последовательность. Однако HpaII требует, чтобы C в этом сайте был метилирован, тогда как MspI расщепляет только неметилированную ДНК в этом сайте. Следовательно, любые метилированные сайты в последовательности, анализируемой с помощью конкретного зонда, будут расщепляться первым, но не вторым ферментом.

См. Также

Ссылки

  1. ^Саузерн, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Выявление специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии. 98(3): 503–517. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (75) 80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  2. ^Towbin; Стэхелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения». PNAS. 76 (9): 4350–4. doi : 10.1073 / pnas.76.9.4350. PMC 411572. PMID 388439.
  3. ^Бернетт, В. Нил (апрель 1981 г.). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфат-полиакриламид натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с использованием антител и радиоактивного йода белка А». Аналитическая биохимия. 112 (2): 195–203. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (81) 90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
  4. ^Биохимия, 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, pg 977

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-09 00:40:23
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте