Войти
Олигонуклеотиды - это короткие молекулы ДНК или РНК, олигомеры, которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании, исследованиях и криминалистике. Эти небольшие кусочки нуклеиновых кислот, обычно производимые в лаборатории путем твердофазного химического синтеза, могут быть изготовлены как одноцепочечные молекулы с любой заданной пользователем последовательностью, поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов., полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование ДНК, молекулярное клонирование и как молекулярные зонды. В природе олигонуклеотиды обычно находятся в виде небольших молекул РНК, которые функционируют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ), или представляют собой промежуточные продукты разложения, полученные в результате разрушения более крупных молекул нуклеиновых кислот.
Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью из нуклеотидных остатков, которые составляют всю молекулу. Длина олигонуклеотида обычно обозначается «-мер » (от греческого meros, «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нуклеотидов) является гексамером, а один из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мерным». Олигонуклеотиды легко связываются специфическим для последовательности образом со своими соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК с образованием дуплексов или, реже, гибридов более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения конкретных последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают ДНК-микрочипы, Саузерн-блоты, анализ ASO, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.
Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2 ’сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии.
Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3 'до 5', следуя стандартной процедуре, называемой «синтетическим циклом». Завершение единственного цикла синтеза приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% на каждой стадии синтеза и наличие побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. Как правило, олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (13-25 нуклеотидов). Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы могут использоваться для выделения продуктов с желаемой последовательностью.
Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней проблемой при разработке методов лечения ASO. Встречающиеся в природе олигонуклеотиды легко разрушаются нуклеазами, ферментом, который расщепляет нуклеотиды и присутствует в клетках любого типа. Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo.
Нуклеозидные органотиофосфатные (PS) аналоги нуклеотидов дают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. свойства. Ключевыми полезными свойствами, которые придают нуклеотиды скелеты PS, являются диастереомерная идентификация каждого нуклеотида и способность легко отслеживать реакции с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно в синтезе олигонуклеотидов. Модификации остова PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. Модификация нуклеотидного остова широко используется, потому что это может быть достигнуто с относительной легкостью и точностью для большинства нуклеотидов.
Другая модификация, полезная для медицинского применения олигонуклеотидов, - 2 'сахарные модификации. Модификация сахара в положении 2 ’увеличивает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов к целевому связыванию, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами. Они также уменьшают неспецифическое связывание с белками, повышая точность нацеливания на определенные белки. Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил.
Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, которые комплементарны выбранная последовательность. В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белка определенных цепей матричной РНК, связываясь с ними в процессе, называемом гибридизацией. Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на специфическую комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если происходит связывание, этот гибрид может быть разложен ферментом РНКазой H. РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в антисмысловом олигонуклеотиде приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%.
Использование морфолино антисмысловых олигонуклеотидов для гена нокдауны у позвоночных, который в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененной экспрессии гена и функции гена, был впервые разработан Джанет Хисман с использованием Ксенопус. Утвержденные FDA препараты морфолино включают этеплирсен и голодирсен. Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для подавления репликации вируса гриппа в клеточных линиях.
Нейродегенеративные заболевания, которые являются результатом одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности воздействовать на очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (БАС), были связаны с изменениями ДНК. которые приводят к неправильным последовательностям РНК и неправильному переводу белков, которые обладают токсическим физиологическим эффектом.
может использоваться как хроматографическая стационарные фазы. Эти фазы были исследованы на предмет разделения олигонуклеотидов.
Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина может использоваться в качестве матрица для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI.
ДНК-микроматрицы являются полезным аналитическим применением олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК, микроматрицы на основе олигонуклеотидов обладают большей контролируемой специфичностью по сравнению с гибридизацией и способностью измерять присутствие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. Один подтип ДНК-микрочипов можно описать как субстраты (нейлон, стекло и т. Д.), С которыми олигонуклеотиды связаны с высокой плотностью. Существует ряд применений микроматриц ДНК в науках о жизни.
