Войти
Представление метилированной молекулы ДНК. Две белые возможности группы метильные группы. Они связаны с двумя молекулами цитозина нуклеотида, которые составляют последовательность ДНК. метилирование ДНК - это биологический процесс, с помощью которого образуются метильные группы добавлен к молекуле ДНК. Метилирование может изменить активность ДНК без изменений. При локализации в промоторе гена метилирование ДНК обычно действует, подавляя транскрипцию гена . У млекопитающих метилирование ДНК необходимо для нормального развития и связанных с рядом ключевых процессов, включая геномный импринтинг, инактивацию Х-хромосомы, репрессию мобильных элементов, старение и канцерогенез.
Два из четырех оснований ДНК, цитозин и аденин, могут быть метилированы. Метилирование цитозина широко распространено как у эукариот, так и у прокариот, хотя скорость метилирования ДНК цитозина может сильно различаться между видами: 14% цитозинов метилированы в Arabidopsis thaliana, От 4% до 8% в Physarum, 7,6% в Mus musculus, 2,3% в Escherichia coli, 0,03% в Drosophila, 0,006% в Dictyostelium и практически нет (от 0,0002 до 0,0003%) в Caenorhabditis или грибах, таких как Saccharomyces cerevisiae и С. pombe (но не N. crassa ). Метилирование аденина наблюдалось в ДНК бактерий, растений, недавно в ДНК млекопитающих, но ему уделяется значительно меньше внимания.
Метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина происходит в том же 5 на пиримидиновом кольце, где основание ДНК тимин метилом группой; это же положение отличает тимин от аналогичного основания РНК урацила, которое не имеет метильной группы. Спонтанное дезаминирование 5-метилцитозина превращает его в тимин. Это приводит к несоответствию T: G. После этого восстановительные механизмы вернут исходную пару C: G; в качестве альтернативы они могут заменить G на A, превратив исходную пару C: G в пару T: A, эффективно изменив основание и введя мутацию. Это неправильно включено основание не будет исправлено во время репликации ДНК, поскольку тимин является основанием ДНК. Если несоответствие не исправлено, и клетка входит в клеточный цикл, нить, несущая Т, будет дополнена буквой A в одной из дочерних клеток, так что мутация станет постоянной. Почти универсальная замена урацила на тимин в ДНК, но не в РНК контроля, могла развиваться как механизм ошибок, чтобы облегчить удаление урацилов, образующихся в результате спонтанного дезаминирования цитозина. Считается, что метилирование ДНК, а также многие из ее современных ДНК-метилтрансфераз произошли от примитивной активности метилирования РНК в раннем мире.
У растений и других организмов метилирование ДНК обнаруживается в трех разных контекстах: CG (или CpG ), CHG или CHH (где H соответствует A, T или C). Однако у млекопитающих метилирование ДНК почти исключительно обнаруживается в динуклеотидах CpG, причем цитозины на цепях обычно метилированы. Метилирование не-CpG может наблюдаться в эмбриональных стволовых клетках, а также показано в нервном развитии. Кроме того, не-CpG-метилирование также наблюдалось в гематопоэтических клетках-предшественниках, и оно происходило в основном в контексте CpApC.
Типичный ландшафт метилирования ДНК млекопитающих Характер метилирования ДНК позвоночных очень специфичен по другим с другими организмами. У млекопитающих около 75% динуклеотидов CpG метилировано в соматических клетках, и метилирование ДНК проявляется как состояние по умолчанию, которое необходимо специально исключить из определенных мест. Напротив, геном растений, беспозвоночных, грибов или простейших демонстрирует «мозаичные» паттерны метилирования, когда нацелены только на верх геномных элементов, и они характеризуются чередованием метилированных и неметилированных доменов.
Высокая CpG-метилирование в геномах млекопитающих имеет эволюционную стоимость, увеличивает частоту спонтанных мутаций. Потеря аминогрупп происходит с высокой скоростью для цитозинов с различными последствиями в зависимости от их метилирования. Метилированные остатки C спонтанно дезаминируют с образованием остатков T с течением времени; Следовательно, динуклеотиды CpG устойчиво дезаминируются до динуклеотидов TpG, о чем свидетельствует недостаточная представленность динуклеотидов CpG в геноме человека (они встречаются только с 21% ожидаемых частот). (С другой стороны, спонтанное дезаминирование неметилированных остатков C приводит к образованию остатков U, изменение, которое быстро распознается и восстанавливается клеткой.)
У млекопитающих единственное Исключение для этого глобального истощения CpG находится в особой категории GC- и CpG-богатых последовательностей, называемых островками CpG, которые обычно неметилированы и, следовательно, сохраняют ожидаемое содержание CpG. Островки CpG обычно оценивают в области 1) длиной более 200 пар оснований, 2) оцененным G + C более 50%, 3) наблюдаемым к ожидаемому CpG более 0,6, иногда используются. Исключая повторяющаяся последовательность, в геноме человека насчитывается около 25000 CpG-островков, 75% из которых имеют длину менее 850 пар оснований. Они используются регуляторными единицами, и 50% островков CpG расположены в областях промоторов генов, а еще 25% лежат в телах часто генов, выступающих в качестве альтернативных промоторов. И наоборот, около 60-70% генов человека имеют островок CpG в своей промоторной области. Большинство CpG-островков конститутивно неметилировано и обогащено для пермиссивной модификации хроматина, такой как метилирование H3K4. В соматических тканях только 10% CpG-островков метилированы, большинство из которых изготовлены в межгенных и внутригенных областях.
Метилирование ДНК, вероятно, в некоторой степени присутствовало у очень ранних предков эукариот. Практически в проанализированном организме метилирование в промоторных областях отрицательно коррелирует с экспрессией генов. CpG-плотные промоторы активно транскрибируемые генов никогда не метилируются, но, наоборот, транскрипционно молчащие гены не обязательно несут метилированный промотор. У мышей и человека около 60–70% генов имеют CpG-островки в их промоторной области, и большинство этих CpG-островков остаются неметилированными независимо от транскрипционной активности гена как в дифференцированных, так и в недифференцированных типах клеток. Следует отметить, что в то время как метилирование ДНК CpG-островков однозначно связано с репрессией транскрипции, функция метилирования ДНК в CG-бедных промоторах остается неясной; хотя имеется мало доказательств того, что это может быть функционально значимым.
Метилирование ДНК может влиять на транскрипцию генов двумя способами. Во-первых, метилированная ДНК может препятствовать связыванию транскрипционных белков с геном, а во-вторых, что более важно, метилированная ДНК может быть связыванием белками, известными как связывание метил-CpG. белки домена (MBD). Затем белки MBD привлекают в локус дополнительные белки, такие как деацетилазы гистонов и другие белки ремоделирования хроматина, которые могут модифицировать гистоны, тем самым формируется компактный неактивный хроматин, называемый гетерохроматином. Эта связь между метилированием ДНК и хроматой хроматина очень важна. В частности, потеря метил-CpG-связывающего белка 2 (MeCP2) причастна к синдрому Ретта ; и белок 2-метил-CpG-связывающего домена (MBD2) опускание транскрипции гиперметилированных генов при «раке».
Метилирование ДНК является мощным репрессором транскрипции, по крайней мере, в контекстах с высокой плотностью CpG. Транскрипционная генов, кодирующих белок, по-видимому, фактически ограничена очень специфическими классами генов, постоянно которые молчать и во всех тканях. Хотя метилирование ДНК не обладает гибкостью, необходимой для тонкой регуляции генов, его стабильность идеальна для постоянного сайленсинга мобильных элементов. Контроль транспозонов - одна из самых древних функций метилирования ДНК, которая присуща животным, растениям и множеству простейших. Есть даже предположение, что метилирование ДНК развилось именно для этой цели.
Функция, которая кажется даже более консервативной, чем молчание транспозонов, положительно коррелирует с экспрессией генов. Почти у всех видов, где присутствует метилирование ДНК, метилирование ДНК особенно обогащено высокотранскрибируемыми генами. Функция метилирования тела гена изучена недостаточно. Совокупность доказывает, что он может регулировать сплайсинг и подавлять активность внутригенных транскрипций (криптических промоторов или мобильных элементов). Метилирование гена-тельца, по-общему, связанное с метилированием H3K36. Ужей дрожжей и млекопитающих метилирование H3K36 в сильном обогащении высокотранскрибируемыми генами. По крайней мере, в дрожжах H3K36me3 рекрутирует элементы, такие как гистондеацетилазы, для конденсации хроматина и предотвращение активации скрытых стартовых сайтов. У млекопитающих домен PWWP DNMT3a и DNMT3b связывается с H3K36me3, и эти два ферментации привлекаются к активным транскрибируемым генам в организме.
Динамика метилирования ДНК во время эмбрионального развития мыши. E3.5-E6 и т. Д. Относятся к дням после оплодотворения. PGC: первичные зародышевые клетки паттерны метилирования ДНК в степени стираются, а затем восстанавливаются между поколениями у млекопитающих. Практически все метилирование от родителей стирается, сначала во время гаметогенеза, а затем в начале эмбриогенеза, причем каждый раз происходит деметилирование и реметилирование. Деметилирование в раннем эмбриогенезе происходит в доимплантационный период на двух стадиях - сначала в зиготе, в течение нескольких циклов эмбриональной репликации морулы и бластулы. Затем происходит волна метилирования во время стадии имплантации эмбриона с островками CpG, защищенными от метилирования. Это приводит к глобальной репрессии и позволяет генам домашнего хозяйства во всех клетках. На стадии после имплантации паттерны метилирования зависят от стадии и ткани, с изменениями, которые определяют каждый отдельный тип клеток, стабильно сохраняющийся в течение длительного периода.
В то время как метилирование ДНК само по себе не является подавления транскрипции., тем не менее считается, что это представляет собой «заблокированное» состояние, которое определенно инактивирует транскрипцию. В частности, метилирование ДНК кажется критическим для поддержания моноаллельного сайленсинга в контексте геномного импринтинга и инактивации Х-хромосомы. В этих случаях экспрессированные и молчащие аллели различаются своим статусом метилирования, а потеря метилирования ДНК приводит к потере импринтинга и повторной экспрессии Xist в соматических клетках. Во время эмбрионального развития немногие гены изменяют свой статус метилирования, за важным исключением генов, специфически экспрессируемых в зародышевой линии. Кажется, что метилирование ДНК абсолютно необходимо в дифференцированных клетках, поскольку нокаут любой из трех компетентных ДНК-метилтрансфераз приводит к эмбриональной или послеродовой летальности. Напротив, метилирование ДНК в недифференцированных типах клеток, таких как внутренняя клеточная масса бластоцисты, примордиальные половые клетки или эмбриональные стволовые клетки. Метилирование ДНК, по-видимому, ограниченное количество напрямую регулируется только генов, то есть отсутствие метилирования ДНК вызывает гибель дифференцированных клеток, остается открытым вопросом.
Из-за феномена геномного импринтинга материнские и отцовские геномы по-разному марки изменяются и должны быть правильно перепрограммированы каждый раз, когда они проходят через зародышевую линию. Следовательно, во время гаметогенеза в первичных зародышевых клетках должны быть стерты и восстановлены исходные паттерны бипорентского метилирования ДНК в зависимости от пола передающего родителя. После оплодотворения отцовский и материнский геномы снова деметилируются и реметилируются (за исключением дифференциально метилированных, связанных с импринтированными генами). Это перепрограммирование, вероятно, необходимо для тотипотентности новообразованного эмбриона и стирания приобретенных эпигенетических изменений.
При раке
При раке
При раке рак, промотор гена CpG-островки приобретают аномальное гиперметилирование, что приводит к подавлению транскрипции, которое может быть унаследовано дочерними клетками после деления клеток. Изменения метилирования ДНК были признаны важным компонентом развития рака. Гипометилирование, как правило, связано с хромосомной нестабильностью и потерей импринтинга, тогда как гиперметилирование связано с промоторами и может быть вторично по отношению к глушению гена (супрессора онкогена), но может быть целью эпигенетической терапии.
Глобальное гипометилирование также. в развитии и прогрессировании рака посредством различных механизмов. Обычно наблюдается гиперметилирование генов-супрессоров опухолей и гипометилирование онкогенов.
Как правило, при прогрессировании рака заглушаются или активируются сотни генов. Хотя подавление некоторых генов происходит в результате мутации, большая часть подавления канцерогенных генов приводит к изменению метилирования ДНК (см. метилирование ДНК при раке ). Метилирование ДНК, вызывающее молчание при раке, обычно происходит во множестве сайтов CpG на островках CpG, которые присутствуют в промоторах генов, кодирующих белок.
Измененные экспрессии микроРНК также заглушают или активируют многие гены при прогрессировании рака (см. микроРНК при раке ). Измененная экспрессия микроРНК происходит за счет гипер / гипометилирования сайтов CpG в островках CpG в промоторах, контролирующих транскрипцию микроРНК.
молчание ДНК гены репарации посредством метилирования CpG-островков в их промоторах, по-видимому, особенно важны при прогрессировании рака (см. метилирование генов репарации ДНК при раке ).
Эпигенетические модификации, такие как метилирование ДНК, вовлечены в сердечно-сосудистые заболевания, включая атеросклероз. В моделях атеросклероза на животных сосудистая ткань, а также клетки крови, такие как мононуклеарные клетки крови, демонстрируют глобальное гипометилирование со специфическими генов областями гиперметилирования. Полиморфизмы метилирования 1-я инстанция в качестве раннего инструмента обнаружения атеросклероза, как они присутствуют до того, как наблюдаются ранний инструмент, обнаружение риска.
Два типа клеток, нацеленных на полиморфизмы метилирования ДНК: моноциты и лимфоциты, которые испытывают общее гипометилирование. Одним из предполагаемых механизмов глобального гипометилирования является повышенный уровень гомоцистеина, вызывающий гипергомоцистеинемию, известный фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. Высокий уровень гомоцистеина в плазме подавляет ДНК-метилтрансферазы, что вызывает гипометилирование. Гипометилирование ДНК влияет на гены, которые изменяют пролиферацию гладкомышечных клеток, вызывают дисфункцию эндотелиальных клеток и увеличивают количество медиаторов воспаления, все из которых имеют решающее значение в формировании атеросклеротических повреждений. Высокий уровень гомоцистеина также приводит к гиперметилированию CpG-островков в промоторной области гена рецептора эстрогена альфа (ERα), вызывающего его подавление. ERα обеспечивает от атеросклероза благодаря своему действию супрессора роста, заставляя заставлять гладких мышц оставаться в состоянии покоя. Таким образом, гиперметилирование промотора ERα позволяет гладкой мускулатуры интимно чрезмерно пролиферировать и вносить в развитие атеросклеротического воздействия.
Другой ген, который испытывает изменение изменения метилирования при атеросклерозе, - это переносчик монокарбоксилата (MCT3), который производит белок, ответственный за транспорт лактата и других кетоновых тел из типов клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов. У пациентов с атеросклерозом наблюдается усиление метилирования CpG-островков в экзоне 2, что снижает экспрессию белка MCT3. Подавление MCT3 нарушает транспорт лактата и увеличивает пролиферацию гладкомышечных клеток, что способствует атеросклеротическому поражению. Эксперимент ex vivo с использованием деметилирующего агента Децитабин (5-аза-2-дезоксицитидин), как было показано, индуцирует экспрессию MCT3 дозозависимым образом, поскольку все гиперметилированные сайты в экзоне 2 CpG-островка после обработки становятся деметилированными.. Это может служить новым терапевтическим средством для лечения атеросклероза, хотя исследования на людях до сих пор не проводились.
У людей и других уровней метилирования ДНК могут быть использованы точные определения клеток и структур, сформированные точные эпигенетические часы.
A продольное исследование детей-близнецов, что в возрасте от 5 до 10 лет наблюдалась дивергенция метилирования. закономерности из-за экологических и генетических факторов. Во время старения происходит глобальная потеря метилирования ДНК.
В исследовании, в котором анализировались полные метиломы ДНК CD4 Т-клетки у новорожденного, 26-летнего человека и 103-летнего человека. Было замечено, что потеря метилирования пропорциональна возрасту. Гипометилированные CpG, наблюдаемые в ДНК столетнего возраста по сравнению с новорожденными, покрывали все геномные компартменты (промоторы, межгенные, интронные и экзонные области). Однако с возрастом некоторые гены становятся гиперметилированными, в том числе гены рецептора эстрогена, p16 и инсулиноподобного фактора роста 2.
Было показано, что упражнения высокие нагрузки приводят к снижению метилирования ДНК в скелетных мышцах. Метилирование промотора PGC-1α и PDK4 сразу же снижалось после упражнений высокой интенсивности, тогда как метилирование PPAR-γ не снижалось до трех часов после тренировки. В то же время шесть месяцев вызывают усиление метилирования в жировой ткани. Одно исследование показало возможное усиление глобального метилирования геномной ДНК белых кровяных телец при большей физической активности у лиц, не являющихся выходцами из Латинской Америки.
Исследование, которое исследовали метилом В-клеток на протяжении их цикла дифференцировки с использованием полногеномного бисульфитного секвенирования (WGBS), показали, что наблюдается гипометилирование от самых ранних стадий до самых дифференцированных стадий. Наибольшая разница в метилировании наблюдается между стадиями В-клеток зародышевого центра и В-клеток памяти. Кроме того, это исследование показало сходство между В-клеточными опухолями и долгоживущими В-клетками в их сигнатурах метилирования ДНК.
Два обзора суммируют доказательства того, что изменения метилирования ДНК в нейроны головного мозга важны для обучения и памяти. Контекстуальное воспоминание страха (форма ассоциативного обучения) у животных, таких как мыши и крысы, происходит быстро и надежно в созданиианий. У мышей и крыс контекстуальное кондиционирование страха в течение 1-24 часов связано с измененным метилированием нескольких тысяч цитозинов ДНК в генах нейронов гиппокампа. Через двадцать четыре часа после контекстуального кондиционирования страха 9,2% генов в нейронах гиппокампа крысы дифференцированно метилированы. У мышей, при исследовании через четыре недели после кондиционирования, метилирование и деметилирование гиппокампа было возвращено к исходным наивным условиям. гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся. Для таких мышей через четыре недели после контекстуального кондиционирования страховочные дифференциальные CpG метилирования и деметилирования памяти произошли в корковых нейронах во время поддержания, и в их передней поясной коре головного мозга было 1223 различных метилированных гена... Активные метилировании и деметилировании ДНК нейронов, по-видимому, как регуляторы <129инаптического масштабирования и передачи глуматного рецептора в обучении и формировании памяти.
Возможные пути метилирования и деметилирования цитозина. Сокращения: S-аденозил-L-гомоцистеин (SAH ), S-аденозил-L-метионин (SAM ), <235.>ДНК-метилтрансфераза (ДНК-МТаза ), урацил-ДНК-гликозилаза (UNG )В клетках млекопитающих метилирование ДНК происходит в основном в положении C5 динуклеотидов CpG и осуществляется двумя классами ферментативной активности - поддерживающим метилированием и метилированием de novo.
Поддерживающая активность метилирования необходимой метилирования ДНК после цикла репликации клеточной ДНК ДНК-метилтрансферазы (DNMT) DNMT1 - это предлагаемая поддерживающая метилтрансфераза, которая отвечает за копирование паттернов метилирования ДНК в дочерние цепи во время репликации ДНК, которые не метилированы и со временем приведены к пассивному деметилированию. эмбриональными летальными примерно на 9-й день из-за необходимости мент активности DNMT1 для развития в клетках млекопитающих.
Считается, Ч то DNMT3a и DNMT3b являются de novo метилтрансферазами, которые на ранней стадии развития устанавливают паттерны метилирования ДНК. DNMT3L - это белок, гомологичный другим DNMT3, но не обладающий каталитической активностью. Вместо этого DNMT3L помогает de novo метилтрансферазам, увеличивая их способность связываться с ДНК и стимулировать их активность. У мышей и крыс есть третий функциональный фермент de novo метилтрансфераза, названный DNMT3C, который развился как паралог Dnmt3b в результате тандемной дупликации у общего предка грызунов Muroidea. DNMT3C катализирует метилирование промоторов мобильных элементов во время раннего сперматогенеза, активность, которая, как было показано, важна для их эпигенетической репрессии и мужской фертильности. Пока неясно, полагаются ли у других млекопитающих, которые не имеют DNMT3C (например, люди), DNMT3B или DNMT3A для de novo метилирования мобильных элементов в зародышевой линии. Наконец, DNMT2 (TRDMT1) был идентифицирован как гомолог ДНК-метилтрансферазы, обеспечивающий все 10 мотивов последовательностей общих для всех ДНК-метилтрансфераз; однако DNMT2 (TRDMT1) не метилирует ДНК, а вместо этого метилирует цитозин-38 в антикодоновой петле РНК-переносчика аспарагиновой кислоты.
снова экспрессировать эти гены путем ингибирования ДНК-метилированных ДНК.. 5-Аза-2'-дезоксицитидин (децитабин ) представляет собой аналог нуклеозида, который ингибирует DNMT, улавливая их в ковалентный комплекс на ДНК, предотвращает стадию катализа β-элиминирования, таким образом что приводит к деградации ферментов. Однако для того, чтобы децитабин был активным, он должен быть включен в геном клетки, что может вызвать мутации в дочерних клетках, если клетка не погибнет. Кроме того, децитабин токсичен для костного мозга, что ограничивает его терапевтического окна. Эти ловушки приводят к разработке методов лечения антисмысловой РНК, которые нацелены на DNMT путем деградации их мРНК и предотвращения их трансляции. Однако в настоящее время неясно, достаточно ли нацеливания только на DNMT1 для реактивации генов-супрессоров опухолей, подавленных метилированием ДНК.
Значительный прогресс был достигнут в понимании метилирования ДНК в модельном растении Arabidopsis thaliana. Метилирование ДНК у растений отличается от метилирования ДНК у млекопитающих: в то время как метилирование ДНК у млекопитающих в основном происходит по нуклеотиду цитозина в сайте CpG, у растений цитозин может быть метилирован в сайтах CpG, CpHpG и CpHpH, где H представляет собой любой нуклеотид, но не гуанин. В целом ДНК арабидопсиса сильно метилирована, масс-спектрометрический анализ показал, что модифицируется 14% цитозинов.
Основными ферментами ДНК-метилтрансферазы арабидопсиса, которые переносят и ковалентно присоединяют метильные группы к ДНК, являются DRM2, MET1 и CMT3. Оба белка DRM2 и MET1 обладают гибридом с метилтрансферазами млекопитающих, DNMT3 и DNMT1, соответственно, тогда как белок CMT3 является уникальным для царства растений. В настоящее время существует два класса ДНК-метилтрансфераз: 1) класс de novo или ферментов, которые представляют новые метилирования на ДНК; 2) поддерживающий класс, который распознает метки метилирования на родительской цепи ДНК и передает новое метилирование дочерним цепям после репликации ДНК. DRM2 - единственный фермент, который считается ДНК-метилтрансферазой de novo. Было также показано, что DRM2, наряду с MET1 и CMT3, участвует в поддержании меток метилирования посредством репликации ДНК. Другие ДНК-метилтрансферазы экспрессируются в растениях, но не имеют известных функций (см. базу данных хроматина ).
Неясно, как показывает данные о том, что для многих (хотя и не всех) мест РНК-направленное метилирование ДНК (RdDM) участвует. При RdDM специфические транскрипты РНК производятся из матрицы геномной ДНК, и эта РНК образует вторичные структуры, называемые молекулами двухцепочечной РНК. Двухцепочечные РНК посредством путей либо малой интерферирующей РНК (siRNA ), либо микроРНК (miRNA ), которые направляют de novo метилирование ДНК в исходном геномном участке, который продуцирует РНК. Считается, что этот вид важен для клеточной защиты от РНК-вирусов и / или транспозонов, которые часто образуют двухцепочечную РНК, которая может быть мутагенной по отношению к геному хозяина.. Путем метилирования их геномной локализации посредством пока еще плохо изученного механизма они отключаются в клетке, защищая геном от их мутагенного действия. Недавно было показано, что метилирование ДНК является основным детерминантой формирования эмбриогенных культурных эксплантатов у древесных растений и основным механизмом, объясняющим слабую реакцию зрелых эксплантов на соматический эмбриогенез у растений (Isah, 2016).
Различные отряды насекомых демонстрируют различные паттерны метилирования ДНК, от почти неопределяемых уровней у мух до низких уровней у бабочек и выше. в настоящих багах и некоторых тараканах (до 14% всех сайтов CG в Blattella asahinai ).
Функциональное метилирование ДНК было обнаружено у медоносных пчел. Метки метилирования ДНК в основном находятся на теле гена, и современные мнения о функциях метилирования ДНК - это регуляция генов альтернативного сплайсинга
Уровни метилирования ДНК у Drosophila melanogaster практически не поддаются обнаружению. Чувствительные методы, применяемые к ДНК дрозофилы. Предлагаемые уровни находятся в диапазоне 0,1–0,3% от общего цитозина. Этот низкий уровень метилирования, по-видимому, обусловлен паттернами геномных последовательностей, которые сильно отличаются от паттернов, наблюдаемых у людей или других животных растений или видов на сегодняшний день. Геномное метилирование у D. melanogaster было обнаружено по специфическим коротким мотивам (сконцентрированным в специфических мотивах следовать из 5 оснований, которые богаты CA и CT, но лишены гуанина) и не зависит от активности DNMT2. Кроме того, высокочувствительные подходы масс-спектрометрии теперь присутствуют низкие (0,07%), но значимых уровней метилирования аденина на самых ранних стадиях эмбриогенеза дрозофилы.
Многие грибы имеют низкие уровни (от 0,1 до 0,5%) метилирования цитозина, тогда как у других грибов метилировано до 5% генома. Это значение, по-видимому, рассматривается как среди видов, так и среди изолятов одного и того же вида. Также есть доказательства того, что метилирование ДНК может участвовать в специфическом для состояния состоянии контроле экспрессии гена в грибах. Однако при пределе обнаружения 250 аттомолей при использовании сверхвысокой чувствительности масс-спектрометрии метилирование ДНК не было подтверждено у одноклеточных видов дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe, что указывает на то, что дрожжи не обладают этой модификацией ДНК.
Хотя пивные дрожжи (Saccharomyces ), делящиеся дрожжи (Schizosaccharomyces ) и Aspergillus flavus не обнаруживают метилирования ДНК, модельный нитчатый гриб Neurospora crassa имеет хорошо охарактеризованную систему метилирования. Несколько генов контролируют метилирование нейроспоры, а также мутация ДНК-метилтрансферазы, dim-2, устраняет все метилирование ДНК, но не влияет на рост или половое размножение. В то время как геном Neurospora имеет очень мало повторяющуюся ДНК, половина метилирования происходит в повторяющейся ДНК, включая реликты транспозона и центрерную ДНК. Способность оценивать другие важные явления в генетическом контексте с дефицитом ДНК-метилазы делает Neurospora системой изучения метилирования ДНК.
метилирование ДНК в значительной степени отсутствует у Dictyostelium discoidium, где оно, по-видимому, встречается примерно в 0,006% цитозинов. Напротив, метилирование ДНК широко распространено в Physarum polycephalum, где 5-метилцитозин составляет до 8% от общего количества цитозина
аденин или цитозин метилирование часть системы рестрикционной модификации многих бактерий, в которой определенные последовательности ДНК метилируются периодически по всему геному. метилаза - это фермент, который распознает конкретную последовательность и метилирует одно из оснований в этой последовательности или рядом с ней. Чужеродные ДНК (которые не метилированы таким образом), которые вводятся в клетку, разрушаются специфическими для последовательности рестрикционными ферментами и расщепляются. Бактериальная геномная ДНК не распознается этими рестрикционными ферментами. Метилирование нативной ДНК действует как своего рода примитивная иммунная система, позволяя бактериям защищаться от заражения бактериофагом.
E. coli ДНК-аденинметилтрансфераза (Dam) представляет собой фермент с массой ~ 32 кДа, который не относится к системе рестрикции / модификации. Последовательностью распознавания мишени для E. coli Dam является GATC, поскольку метилирование происходит в положении N6 аденина в этой последовательности (G meATC). Три пары оснований, фланкирующие каждую сторону этого сайта, также влияют на связывание ДНК-Dam. Dam играет несколько ключевых ролей в бактериальных процессах, включая восстановление несоответствия, время репликации ДНК и экспрессию генов. В результате репликации ДНК статус сайтов GATC в геноме E. coli изменяется с полностью метилированного на гемиметилированный. Это связано с тем, что аденин, введенный в новую цепь ДНК, неметилирован. Повторное метилирование происходит в течение двух-четырех секунд, за это время исправляются ошибки репликации в новой цепи. Метилирование или его отсутствие является маркером, который позволяет аппарату репарации клетки различать матрицу и растущие нити. Было показано, что изменение активности Dam в бактериях приводит к увеличению скорости спонтанных мутаций. Жизнеспособность бактерий нарушена у мутантов dam, у которых также отсутствуют некоторые другие ферменты репарации ДНК, что дает дополнительные доказательства роли Dam в репарации ДНК.
Одной из областей ДНК, которая дольше сохраняет свой гемиметилированный статус, является точка начала репликации, которая имеет множество сайтов GATC. Это центральный элемент бактериального механизма определения времени репликации ДНК. SeqA связывается с помощью репликации, секвестрируя его и тем самым предотвращая метилирование. Гемиметилированные точки начала репликации неактивны, этот механизм ограничивает репликацию ДНК до одного раза за клеточный цикл.
Экспрессия некоторых генов, например генов, кодирующих экспрессию пилус в E. coli, регулируется метилированием сайтов GATC в промоторной области оперона гена. Условия окружающей среды клеток сразу после репликации ДНК определяют, блок ли метилирование области, проксимальной или удаленной от промоторной области. После создания паттерна метилирования транскрипция гена пилуса блокируется во включенном или выключенном состоянии до тех пор, пока ДНК снова не реплицируется. У E. coli эти пили опероны играют важную роль в вирулентности инфекций мочевыводящих путей. Было высказано предположение, что ингибиторы Dam могут действовать как антибиотики.
С другой стороны, ДНК-цитозинметилаза нацелена на сайты CCAGG и CCTGG для метилирования цитозина в положении C5 (C meC (A / T) GG). Другой фермент метилаза, EcoKI, вызывает метилирование аденинов в последовательностях AAC (N 6) GTGC и GCAC (N 6) GTT.
У Clostridioides difficile метилирование ДНК по мотиву-мишени CAAAAA влияет на споруляцию, ключевой этап передачи заболевания, а также на длину клетки, образование биопленок и колонизацию хозяина.
Большинство штаммов, используемых молекулярными биологами, являются производными E. coli K-12 и обладают как Dam, так и Dcm, но есть коммерчески доступные штаммы, которые являются dam- / dcm- (отсутствие активности любой метилазы). Фактически, можно неметилировать ДНК, экстрагированную из штаммов dam + / dcm +, превращая ее в штаммы dam- / dcm-. Это поможет переваривать последовательность, которые не распознаются чувствительными к метилированию рестрикционными ферментами.
рестрикционный фермент DpnI может распознавать сайты 5'-GmeATC-3 'и переваривать метилированную ДНК. Основное использование для исследователей состоит в разложении матричной ДНК после ПЦР (в продуктах ПЦР отсутствует метилирование, поскольку в реакциях отсутствуют метилазы). Точно так же некоторые коммерчески доступные рестрикционные ферменты чувствительны к метилированию на своих родных сайтах рестрикции, как упоминалось ранее, на ДНК, прошедшие через штамм dam- / dcm-, чтобы разрез.
Метилирование ДНК с помощью следующих анализов, используемых в настоящее время в научных исследованиях:
Дифференциально метилированные области - это геномные области с статусом метилирования нескольких образцов (ткани, клетки, индивидуумы или другие), рассматриваются как возможные функциональные области, участвующие в регуляции транскрипции генов. Идентификация DMR среди множества тканей (T-DMR) обеспечивает всесторонний обзор эпигенетических различных тканей человека. Например, эти метилированные области, которые уникальны для конкретной ткани, позволяют различать тип ткани, такой как сперма и вагинальная жидкость. Текущее исследование, проведенное Ли и др., Показало, что DACT1 и USP49 положительно идентифицированы путем генетического изучения T-DMR. Использование T-DMR полезно при идентификации различных биологических жидкостей, обнаруженных на местах преступления. Исследователи в области судебной медицины в настоящее время ищут новые T-DMR в генах, чтобы использовать их в качестве маркеров в судебном анализе ДНК. DMR между раковыми и нормальными образцами (C-DMR) демонстрируют аберрантное метилирование при раке. Хорошо известно, что метилирование ДНК связано с дифференцировкой и пролиферацией клеток. Многие DMR были обнаружены на стадиях разработки (D-DMR) и в процессе перепрограммирования (R-DMR). Кроме того, существуют внутрииндивидуальные DMR (Intra-DMR) с продольными изменениями глобального метилирования ДНК с использованием данного индивидуума. Существуют также межиндивидуальные DMR (Inter-DMR) с разными паттернами метилирования у нескольких индивидуумов.
QDMR (количественно дифференцированно метилированные области) - это количественный подход для количественной оценки различий в метилировании и идентификации DMR из профилей метилирования по всему геному. путем адаптации энтропии Шеннона. Отсутствие платформ и видов QDMR делает его применимым к различным метилирования. Этот подход обеспечивает эффективный инструмент для высокопроизводительной идентификации функциональных регионов, участвующих в эпигенетической регуляции. QDMR можно использовать в качестве инструмента для количественной оценки различных в метилировании и идентификации DMR в нескольких образцах.
Анализ генов (также известный как анализ путей; обычно выполняемые инструменты, такие как DAVID, GoSeq или GSEA) были Показано, что оно сильно смещено при применении к данным о метилировании с высокой пропускной способностью (например, MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq и т. Д.), И таким образом, широкий спектр исследований ошибочно сообщил о гиперметилировании генов, связанном с развитием и дифференцировкой. ; Было высказано предположение, что это можно исправить, используя перестановки меток в образцах или статистическую модель для контроля в количестве зондов CpG / сайтов CpG, нацеленных на каждый ген.
- области генома с определенными паттернами метилирования в конкретном биологическом состоянии, например ткань, тип клетки, индивидуум - рассматриваются как возможные функциональные области, участвующие в регуляции транскрипции генов. Хотя разные типы клеток человека могут иметь один и тот же геном, эти клетки имеют разные метиломы. Систематическая идентификация и характеристики меток метилирования для разных клеток имеют решающее значение для понимания сложной регуляторной сети для определения судьбы клеток. Хунбо Лю и др. предложили основанную на энтропии структуру, названную SMART, для интеграции полногеномных бисульфитных метиломов, секвенирующих 42 / клетки человека, и идентифицировали 757 887 сегментов генома. Почти 75% сегментов однородное метилирование для всех типов клеток. Из 25% сегментов они идентифицированы метки гипо / гиперметилирования, специфичные для типов клеток, используя статистический подход, представили атлас меток метилирования человека. Дальнейший анализ показал, что метки гипометилирования, специфичные для типа клеток, были обогащены посредством H3K27ac и сайтов связывания факторов транскрипции специфическим для типа клеток образом. В частности, они наблюдали, что метки гипометилирования, специфичные для определенного типа клеток, связаны с суперинхансерами, специфичными для определенного типа клеток, которые управляют экспрессией генов клеточной идентичности. Эта структура обеспечивает дополнительную функциональную аннотацию генома человека и помогает в критических особенностях гипометилирования, специфических типов клеток.
Основанный на энтропии инструмент анализа специфического метилирования и составления отчетов, названный «SMART», который фокусируется на интеграции большого количества ДНК-метиломов для идентификации новых маркеров метилирования, специфичных для определенного типа клеток. Последняя версия SMART сосредоточена на трех основных функциях, включая указание индексации метилированных областей (DMR) посредством сегментации генома, идентификацию DMR из предопределенных интересующих областей и идентификацию дифференциально метилированных сайтов CpG.
метилирование ДНК позволяет анализировать несколько тканей за один анализ, а также идентифицировать небольшие количества биологических жидкостей с использованием выделенной ДНК. Обычно два подхода к метилированию ДНК - это либо чувствительные к метилированию рестрикционные ферменты, либо обработка бисульфитом натрия. Метилированные чувствительные рестрикционные ферменты работают, расщепляя специфические CpG, цитозин и гуанин, разделенные только одной фосфатной группой, сайты узнавания, когда CpG метилирован. Напротив, неметилированные цитозины превращаются в урацил, и при этом метилированные цитозины остаются метилированными. В частности, профили метилирования могут дать представление о том, когда и как биологические жидкости оставлены на месте преступления, определить тип биологической жидкости и приблизительный возраст, пол и фенотипические характеристики преступников. Исследования указывают на маркеры, которые можно использовать для метилирования ДНК. Решение, какой маркер использовать для анализа, является одним из первых шагов при идентификации биологических жидкостей. Как правило, маркеры выбираются путем изучения ранее проведенных исследований. Выбранные маркеры идентификации должны давать положительный результат для одного типа клеток. Одна часть хромосомы, которая является областью фокуса при метилировании ДНК, - это тканеспецифичные дифференциально метилированные области, T-DMR. Степень метилирования T-DMR меняется в зависимости от жидкости организма. Исследовательская группа разработала двойную систему маркеров. Первый маркер метилирован только в целевой жидкости, тогда как второй метилируется в остальных жидкостях. Например, если маркер венозной крови A не метилирован, а маркер венозной крови B метилирован в жидкости, это указывает на присутствие только венозной крови. Напротив, если маркер венозной крови A метилирован, а маркер венозной крови B не метилирован в некоторой жидкости, это указывает на то, что венозная кровь находится в смесях жидкостей. Некоторыми примерами маркеров метилирования ДНК являются Mens1 (менструальная кровь), Spei1 (слюна) и Sperm2 (семенная жидкость).
Метилирование ДНК обеспечивает относительно хорошую чувствительность при идентификации и обнаружении жидкостей организма. В одном исследовании для достижения успешных результатов требовалось всего десять нанограмм образца. Метилирование ДНК обеспечивает хорошее распознавание смешанных образцов, поскольку оно включает маркеры, дают сигналы «включено» или «выключено». Метилирование ДНК не невосприимчиво к внешним условиям. Даже в деградированных условиях с использованием методов метилирования ДНК маркеры достаточно стабильны. В частности, в одном исследовании было обнаружено, что не было каких-либо заметных изменений в паттернах метилирования в течение длительного периода времени.
Метилирование ДНК также может быть обнаружено с помощью компьютерных моделей через сложные алгоритмы и методы. Вычислительные модели могут облегчить глобальное профилирование метилирования ДНК по хромосомам, и часто такие модели быстрее и дешевле в исполнении, чем биологические анализы. К таким современным вычислительным моделям относятся Bhasin, et al., Bock, et al., И Zheng, et al. Вместе с биологическим анализом эти методы значительно облегчают анализ метилирования ДНК.
 | На Викискладе есть материалы, связанные с ДНК метилирование. |
