Войти
Рис. 1: Схема бисульфитного преобразования последовательности образцов геномной ДНК. Нуклеотиды синего цвета - неметилированные цитозины, превращенные в урацилы бисульфитом, а красные нуклеотиды - это 5-метилцитозины, устойчивые к превращению. 
Рисунок 2: Схема химической реакции, которая лежит в основе катализируемого бисульфитом превращения цитозина в урацил. секвенирование (также известное как бисульфитное секвенирование ) - это использование бисульфитной обработки ДНК перед рутинным секвенированием, чтобы определить характер метилирования. метилирование ДНК было первой обнаруженной эпигенетической меткой и остается наиболее изученной. У животных он преимущественно включает добавление метильной группы к положению углерода-5 цитозиновых остатков динуклеотида CpG и участвует в репрессии транскрипционная активность.
Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил, но не затрагивает 5-метилцитозин остатков. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Таким образом, обработка бисульфитом вносит специфические изменения в последовательность ДНК, которые зависят от статуса метилирования отдельных остатков цитозина, что дает однонуклеотидную разрешающую информацию о статусе метилирования сегмента ДНК. Для получения этой информации можно выполнить различные анализы измененной последовательности. Таким образом, цель этого анализа сводится к различению между однонуклеотидными полиморфизмами (цитозины и тимидин ), возникающими в результате превращения бисульфита (рис. 1).
Бисульфит При секвенировании используются стандартные методы секвенирования геномной ДНК, обработанной бисульфитом, для определения статуса метилирования динуклеотидов CpG. Другие стратегии, не связанные с секвенированием, также используются для исследования метилирования в конкретных локусах или на уровне генома. Все стратегии предполагают, что индуцированное бисульфитом превращение неметилированных цитозинов в урацил завершено, и это служит основой для всех последующих методик. В идеале используемый метод должен определять статус метилирования отдельно для каждого аллеля . Методы, альтернативные бисульфитному секвенированию, включают комбинированный анализ рестрикции бисульфита и иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP).
Методики анализа ДНК, обработанной бисульфитом, постоянно разрабатываются. Чтобы обобщить эти быстро развивающиеся методологии, было написано множество обзорных статей.
Методологии в целом можно разделить на стратегии, основанные на ПЦР, специфичной для метилирования (MSP) (рис. 4), и стратегии, использующие полимеразную цепь реакция (ПЦР), выполняемая в условиях, не связанных с метилированием (фиг. 3). В методах на основе микрочипов также используется ПЦР, основанная на неметилировании.
Рис. 3. Методы анализа метилирования ДНК, не основанные на ПЦР, специфичных для метилирования. После превращения бисульфита геномная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР, которая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Затем используются многочисленные доступные методы для различения на основе изменений внутри ампликона в результате превращения бисульфита. Первый опубликованный метод анализа метилирования с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, с использованием ПЦР и стандартное секвенирование дидезоксинуклеотида ДНК для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к превращению бисульфита. Праймеры сконструированы так, чтобы быть специфичными для цепи, а также специфичными для бисульфита (т.е. праймеры, содержащие цитозины, не относящиеся к CpG, так что они не комплементарны ДНК, не обработанной бисульфитом), фланкируя (но не вовлекая) интересующий сайт метилирования. Следовательно, он будет амплифицировать как метилированные, так и неметилированные последовательности, в отличие от специфичной для метилирования ПЦР. Все сайты неметилированных цитозинов отображаются как тимины в полученной амплифицированной последовательности смысловой цепи и как аденины в амплифицированной антисмысловой цепи. Путем включения адаптеров для высокопроизводительного секвенирования в праймеры для ПЦР продукты ПЦР можно секвенировать с массовым параллельным секвенированием. Альтернативно и трудоемко, продукт ПЦР можно клонировать и секвенировать. Методы вложенной ПЦР можно использовать для улучшения продукта для секвенирования.
Все последующие методы анализа метилирования ДНК с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, основаны на этом отчете Frommer et al. (Фигура 2). Хотя большинство других методов не являются методами, основанными на истинном секвенировании, термин «бисульфитное секвенирование» часто используется для описания методов анализа метилирования ДНК с превращением бисульфита в целом.
Пиросеквенирование также использовалось для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, без использования ПЦР, специфичной для метилирования. После ПЦР-амплификации интересующей области пиросеквенирование используется для определения бисульфитно-преобразованной последовательности конкретных сайтов CpG в этой области. Отношение C-к-T в отдельных сайтах можно определить количественно на основании количества включенных C и T во время удлинения последовательности. Основное ограничение этого метода - стоимость технологии. Однако пиросеквенирование позволяет расширить его до высокопроизводительных методов скрининга.
Дальнейшее усовершенствование этого метода было недавно описано Wong et al., В котором используются аллель-специфические праймеры, которые включают однонуклеотидные полиморфизмы в последовательность праймера для секвенирования, что позволяет раздельный анализ материнских и отцовских аллелей . Этот метод особенно полезен для анализа геномного импринтинга.
Этот метод основан на методе анализа однонитевого конформационного полиморфизма (SSCA), разработанном для анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP). SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК идентичного размера, но с разными последовательностями на основе дифференциальной миграции в неденатурирующем электрофорезе. В MS-SSCA это используется для различения обработанных бисульфитом, амплифицированных с помощью ПЦР участков, содержащих интересующие сайты CpG. Хотя SSCA не обладает чувствительностью, когда присутствует различие только в одном нуклеотиде, обработка бисульфитом часто вызывает ряд преобразований C-to-T в большинстве представляющих интерес областей, и результирующая чувствительность приближается к 100%. MS-SSCA также обеспечивает полуколичественный анализ степени метилирования ДНК на основе соотношения интенсивностей полос. Однако этот метод предназначен для оценки всех сайтов CpG в целом в интересующей области, а не отдельных сайтов метилирования.
Еще одним методом дифференциации преобразованной ДНК, обработанной бисульфитом, является использование анализа плавления с высоким разрешением (HRM), количественной ПЦР Методика, изначально разработанная для различения SNP. ПЦР ампликоны анализируют непосредственно путем изменения температуры, что приводит к высвобождению интеркалирующего флуоресцентного красителя во время плавления. Степень метилирования, представленная содержанием C-to-T в ампликоне, определяет скорость плавления и последующее высвобождение красителя. Этот метод позволяет проводить прямой количественный анализ в одной пробирке, но оценивает метилирование в амплифицированной области в целом, а не в конкретных сайтах CpG.
MS-SnuPE использует метод удлинения праймера, изначально разработанный для анализа однонуклеотидных полиморфизмов. ДНК превращается в бисульфит, и специфичные для бисульфита праймеры отжигаются с последовательностью до пары оснований непосредственно перед представляющим интерес CpG. Праймеру дают возможность расширить одну пару оснований в C (или T) с использованием ДНК-полимеразы, заканчивающейся дидезоксинуклеотидами, и соотношение C к T определяют количественно.
Для определения этого отношения C: T можно использовать несколько методов. Вначале MS-SnuPE полагался на радиоактивные ddNTP в качестве репортера удлинения праймера. Также можно использовать методы, основанные на флуоресценции или пиросеквенирование. Тем не менее, матричная лазерная десорбционная ионизация / время пролета (MALDI-TOF ) масс-спектрометрический анализ для различения двух продуктов удлинения полиморфных праймеров может быть использован, по существу, на основе теста GOOD, разработанного для генотипирования SNP. Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (IP-RP- ВЭЖХ ) также использовалась для различения продуктов удлинения праймера.
Недавно описанный метод Ehrich et al. дополнительно использует преимущества бисульфитных превращений путем добавления стадии расщепления, специфичной для оснований, для усиления информации, полученной в результате нуклеотидных изменений. Сначала использовав in vitro транскрипцию интересующей области в РНК (добавив сайт РНК-полимеразы промотор к праймеру ПЦР в начальная амплификация), РНКазу A можно использовать для расщепления РНК транскрипта по основанию-специфичным сайтам. Поскольку РНКаза A расщепляет РНК специфически по цитозину и урацилу рибонуклеотидам, специфичность к основанию достигается добавлением устойчивого к расщеплению dTTP, когда цитозин -специфическое (C-специфическое) расщепление и включение dCTP, когда желательно урацил-специфическое (U-специфическое) расщепление. Затем расщепленные фрагменты можно анализировать с помощью MALDI-TOF. Обработка бисульфитом приводит либо к введению / удалению сайтов расщепления посредством преобразований C-to-U, либо к сдвигу массы фрагментов за счет преобразований G-в-A в амплифицированной обратной цепи. C-специфическое расщепление будет специфично разрезаться по всем метилированным сайтам CpG. Анализируя размеры полученных фрагментов, можно определить конкретный паттерн метилирования ДНК сайтов CpG в пределах области, а не определять степень метилирования области в целом. Этот метод продемонстрировал эффективность для высокопроизводительного скрининга, позволяя исследовать многочисленные CpG-сайты во многих тканях экономичным способом.
Рис. 4: ПЦР, специфичная для метилирования, представляет собой чувствительный метод дискриминации и обнаружения интересующей метилированной области с использованием специфичных для метилирования праймеров на геномной ДНК, преобразованной в бисульфит. Такие праймеры будут отжигаться только с метилированными последовательностями и, таким образом, содержащими 5-метилцитозины, устойчивые к превращению бисульфитом. В качестве альтернативы можно использовать неметилированные специфические праймеры. В этом альтернативном методе анализа метилирования также используется ДНК, обработанная бисульфитом, но исключается необходимость секвенирования интересующей области. Вместо этого пары праймеров конструируются так, чтобы быть «метилированно-специфичными» путем включения последовательностей, комплементарных только непревращенным 5-метилцитозинам или, наоборот, «неметилированным специфическим», комплементарным тиминам превращается из неметилированных цитозинов. Метилирование определяется способностью конкретного праймера достигать амплификации. Этот метод особенно полезен для исследования CpG-островков с возможно высокой плотностью метилирования, поскольку повышенное количество пар CpG в праймере увеличивает специфичность анализа. Размещение пары CpG на 3'-конце праймера также улучшает чувствительность. Первоначальный отчет с использованием MSP описал достаточную чувствительность для обнаружения метилирования 0,1% аллелей. В целом, MSP и связанные с ним протоколы считаются наиболее чувствительными при опросе статуса метилирования в конкретном локусе.
. Метод MethyLight основан на MSP, но обеспечивает количественный анализ с использованием количественной ПЦР. Используются метилированные специфические праймеры, а также метилированный репортерный зонд флуоресценции, который отжигается с амплифицированной областью. Альтернативно, праймеры или зонд могут быть сконструированы без специфичности метилирования, если требуется различение между парами CpG в задействованных последовательностях. Количественное определение проводится для метилированной эталонной ДНК. Модификация этого протокола для повышения специфичности ПЦР для успешно преобразованной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) использует дополнительный зонд для определения бисульфит-неконвертированной ДНК для количественной оценки этой неспецифической амплификации.
Дальнейшая методология с использованием MSP. -амплифицированная ДНК анализирует продукты с использованием анализа кривой плавления (Mc-MSP). Этот метод амплифицирует ДНК, преобразованную бисульфитом, с праймерами, специфичными как для метилированного, так и для неметилированного компонентов, и определяет количественное соотношение двух продуктов путем сравнения дифференциальных пиков, полученных при анализе кривой плавления. Метод анализа плавления с высоким разрешением, который использует как количественную ПЦР, так и анализ плавления, был введен, в частности, для чувствительного обнаружения метилирования низкого уровня
микроматрицы методы являются логическим продолжением технологий, доступных для анализа обработанной бисульфитом ДНК, что позволяет проводить анализ метилирования в масштабе всего генома. Олигонуклеотидные микрочипы созданы с использованием пар олигонуклеотидов зонды гибридизации нацелены на интересующие сайты CpG. Один комплементарен неизмененной метилированной последовательности, а другой комплементарен неметилированной последовательности, преобразованной из C в U. Зонды также являются бисульфит-специфичными для предотвращения связывания с ДНК, не полностью преобразованной бисульфитом. Анализ метилирования Illumina - это один из таких анализов, который применяет технологию бисульфитного секвенирования на уровне микроматрицы для получения данных о метилировании всего генома.
Секвенирование бисульфитом широко используется в геномах млекопитающих, однако возникли сложности с открытием новой модификации ДНК млекопитающих 5-гидроксиметилцитозин. 5-Гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат при обработке бисульфитом, который затем читается как C при секвенировании. Таким образом, бисульфитное секвенирование не позволяет различить 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин. Это означает, что результат бисульфитного секвенирования больше нельзя определять только как метилирование ДНК, поскольку он представляет собой смесь 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. Чуан Хе из Чикагского университета разработал метод секвенирования оксидативного бисульфита с помощью Tet, который теперь позволяет различать эти две модификации при разрешении по одной базе.
Бисульфитное секвенирование основано на превращении каждого неметилированного остатка цитозина в урацил. Если преобразование неполное, последующий анализ будет неправильно интерпретировать непревращенные неметилированные цитозины как метилированные цитозины, что приведет к ложноположительным результатам метилирования. Только цитозины в одноцепочечной ДНК подвержены атаке бисульфитом, поэтому денатурация ДНК, подвергаемой анализу, имеет решающее значение. Важно убедиться, что параметры реакции, такие как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и позволяют проводить полное преобразование. Сообщалось, что встраивание ДНК в агарозный гель улучшает скорость превращения за счет физического разделения цепей ДНК.
Основная проблема при бисульфитном секвенировании - это деградация ДНК, которая происходит одновременно с превращением. Условия, необходимые для полной конверсии, такие как длительное время инкубации, повышенная температура и высокая концентрация бисульфита, могут привести к деградации примерно 90% инкубированной ДНК. Учитывая, что исходное количество ДНК часто ограничено, такая обширная деградация может быть проблематичной. Разложение происходит в виде депуринизации, что приводит к случайным разрывам цепей. Следовательно, чем длиннее желаемый PCR ампликон, тем более ограниченным будет количество интактных молекул матрицы. Это могло привести к сбою амплификации ПЦР или потере количественно точной информации об уровнях метилирования в результате ограниченного отбора молекул-матрицы. Таким образом, важно оценить степень деградации ДНК в результате используемых условий реакции и рассмотреть, как это повлияет на желаемый ампликон. Также можно использовать методы для минимизации деградации ДНК, такие как циклическое изменение температуры инкубации.
Потенциально серьезной проблемой после обработки бисульфитом является неполное десульфирование пиримидин остатков из-за недостаточного подщелачивания раствора. Это может ингибировать некоторые ДНК-полимеразы, что затрудняет последующую ПЦР. Однако этой ситуации можно избежать, отслеживая pH раствора, чтобы убедиться, что десульфирование будет завершено.
Последняя проблема заключается в том, что обработка бисульфитом значительно снижает уровень сложности образца, что может быть проблематичным, если необходимо провести несколько реакций ПЦР (2006). Дизайн праймера сложнее, а несоответствующая перекрестная гибридизация более часта.
Достижения в секвенировании бисульфитов привели к возможности их применения в масштабе всего генома, где ранее измерение метилирования ДНК было возможно только с использованием других методов, таких как геномное сканирование по рестрикционным ориентирам. Картирование человеческого эпигенома рассматривается многими учеными как логическое продолжение проекта Human Genome Project. Эта эпигеномная информация будет важна для понимания того, как функция генетической последовательности реализуется и регулируется. Поскольку эпигеном менее стабилен, чем геном, считается, что он важен для взаимодействий ген-среда.
Эпигеномное картирование по своей сути более сложно, чем секвенирование генома, однако, поскольку эпигеном значительно более вариабельна, чем геном . Эпигеном человека меняется с возрастом, различается в разных тканях, изменяется под воздействием факторов окружающей среды и проявляет отклонения при заболеваниях. Однако такое обширное эпигеномное картирование, представляющее различные возрасты, типы тканей и болезненные состояния, могло бы дать ценную информацию о нормальной функции эпигенетических меток, а также о механизмах, ведущих к старению и болезням.
Прямые преимущества эпигеномного картирования включают вероятные достижения в технологии клонирования. Считается, что неспособность произвести клонированных животных с нормальной жизнеспособностью и продолжительностью жизни является результатом несоответствующих образцов эпигенетических меток. Кроме того, паттерны аберрантного метилирования хорошо охарактеризованы во многих раках. Глобальное гипометилирование приводит к снижению стабильности генома, в то время как локальное гиперметилирование гена-супрессора опухоли промоторов часто является причиной их потери функции. Конкретные паттерны метилирования указывают на конкретные типы рака, имеют прогностическое значение и могут помочь выбрать лучший курс лечения.
Во всем мире предпринимаются масштабные попытки картирования эпигенома. и были организованы в рамках проекта Human Epigenome Project. Это основано на многоуровневой стратегии, при которой бисульфитное секвенирование используется для получения профилей метилирования с высоким разрешением для ограниченного числа эталонных эпигеномов, в то время как менее тщательный анализ выполняется на более широком спектре образцов. Этот подход предназначен для максимизации понимания, полученного из заданного количества ресурсов, поскольку картирование всего генома с высоким разрешением остается дорогостоящим мероприятием.
Анализ генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) оказался сильно смещенным при применении к данным метилирования с высокой пропускной способностью (например, бисульфитное секвенирование по всему геному); Было высказано предположение, что это можно исправить, используя перестановки меток в образцах или используя статистическую модель для контроля различий в количестве зондов CpG / сайтов CpG, нацеленных на каждый ген.
5-Метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин читаются как C при бисульфитном секвенировании. Окислительное бисульфитное секвенирование - это метод различения 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина при разрешении по одному основанию. В этом методе используется специфическое (с помощью Tet) химическое окисление 5-гидроксиметилцитозина до 5-формилцитозина, который впоследствии превращается в урацил во время обработки бисульфитом. Единственное основание, которое затем читается как C, - это 5-метилцитозин, что дает карту истинного статуса метилирования в образце ДНК. Уровни 5 ‑ гидроксиметилцитозина также можно определить количественно путем измерения разницы между бисульфитным и окислительным бисульфитным секвенированием.
