Войти
Вилка репликации ДНК. Праймер РНК, помеченный вверху. A праймер представляет собой короткую одноцепочечную нуклеиновую кислоту, используемую всеми живыми организмами в инициации синтеза ДНК. ферменты, ответственные за репликацию ДНК, ДНК-полимеразы, способны только добавлять нуклеотидов к 3'-концу существующего нуклеинового кислота, требующая связывания праймера с матрицей до того, как ДНК-полимераза сможет начать комплементарную цепь. Живые организмы используют только праймеры РНК, тогда как лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, требующие синтеза ДНК in vitro (например, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция ) обычно используют праймеры ДНК, поскольку они более устойчивы к температуре.
РНК-праймеры используются живыми организмами в инициации синтеза цепи ДНК. Класс ферментов, называемых примазами, добавляет праймер комплементарной РНК к считывающей матрице de novo как на ведущей, так и на отстающей цепях. Начиная с свободного 3’-OH праймера, известного как конец праймера, ДНК-полимераза может удлинять вновь синтезированную цепь. ведущая цепь в репликации ДНК синтезируется в виде одной непрерывной части, перемещающейся с репликационной вилкой, для начала синтеза требуется только начальный праймер РНК. В отстающей цепи ДНК-матрица проходит в направлении 5 '→ 3'. Поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания в направлении 3 '→ 5', комплементарном цепи матрицы, ДНК синтезируется «в обратном направлении» короткими фрагментами, удаляющимися от вилки репликации, известными как фрагменты Окадзаки. В отличие от ведущей цепи, этот метод приводит к многократному запуску и остановке синтеза ДНК, что требует нескольких праймеров РНК. Вдоль матрицы ДНК примаза вкрапления праймеров РНК, которые ДНК-полимераза использует для синтеза ДНК в направлении 5 '→ 3'.
Другой пример использования праймеров для синтеза ДНК: обратная транскрипция. Обратная транскриптаза - это фермент, который использует матричную цепь РНК для синтеза комплементарной цепи ДНК. Компонент ДНК-полимеразы обратной транскриптазы требует существующего 3'-конца для начала синтеза.
После вставки фрагментов Окадзаки праймеры РНК удаляются ( механизм удаления отличается у прокариот и эукариот ) и заменяется новыми дезоксирибонуклеотидами, которые заполняют промежутки, где присутствовала РНК. ДНК-лигаза затем соединяет фрагментированные цепи вместе, завершая синтез отстающей цепи.
У прокариот ДНК-полимераза I синтезирует фрагмент Окадзаки, пока он не достигнет предыдущего праймера РНК. Затем фермент одновременно действует как 5 '→ 3' экзонуклеаза, удаляя праймер рибонуклеотиды спереди и добавляя дезоксирибонуклеотиды сзади, пока область не будет заменена ДНК. оставляя небольшой промежуток в основной цепи ДНК между фрагментами Окадзаки, который запечатан ДНК-лигазой.
При удалении эукариотического праймера ДНК-полимераза δ удлиняет фрагмент Окадзаки в 5 '→ 3' В направлении, и при встрече с праймером РНК из предыдущего фрагмента Окадзаки он смещает 5'-конец праймера в одноцепочечный лоскут РНК, который удаляется расщеплением нуклеазой. Расщепление лоскутов РНК включает либо расщепление специфической для структуры лоскута эндонуклеазой 1 (FEN1) коротких лоскутов, либо покрытие длинных лоскутов одноцепочечным ДНК-связывающим белком белком репликации A ( RPA) и последовательное расщепление нуклеазой Dna2 и FEN1.
Схематическое изображение прямого и обратного праймеров для стандартной ПЦР Синтетических праймеров химически синтезированные олигонуклеотиды, обычно ДНК, которые можно настроить для отжига с конкретным сайтом на матричной ДНК. В растворе праймер спонтанно гибридизуется с матрицей посредством спаривания оснований Уотсона-Крика перед тем, как он будет удлинен ДНК-полимеразой. Способность создавать и настраивать синтетические праймеры оказалась бесценным инструментом, необходимым для множества молекулярно-биологических подходов, включающих анализ ДНК. И для метода терминации цепи Сэнгера, и для метода секвенирования ДНК «Next-Gen » требуются праймеры для инициации реакции.
В полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется пара специальных праймеров для направления удлинения ДНК друг к другу на противоположных концах амплифицируемой последовательности. Эти праймеры обычно имеют длину от 18 до 24 оснований и должны кодировать только определенные расположенные выше и ниже сайты амплифицируемой последовательности. Праймер, который может связываться с несколькими участками ДНК, будет амплифицировать их все, исключая цель ПЦР.
При разработке пары праймеров для ПЦР необходимо учитывать несколько критериев. Пары праймеров должны иметь одинаковые температуры плавления, поскольку отжиг во время ПЦР происходит для обеих цепей одновременно, и эта общая температура плавления не должна быть либо слишком выше, либо ниже, чем температура отжига реакции. Праймер с T m (температура плавления), намного превышающий температуру реакционного отжига, может ошибочно гибридизоваться и распространяться в неправильном месте вдоль последовательности ДНК. T m, значительно меньшая, чем температура отжига, может вообще не отжигаться и расширяться.
Кроме того, последовательности праймеров необходимо выбирать для уникального отбора для области ДНК, избегая возможности гибридизации с близкой аналогичной последовательностью. Обычно используемый метод выбора сайта праймера - это поиск BLAST, при котором можно увидеть все возможные области, с которыми может связываться праймер. BLAST-поиском можно подвергнуть как нуклеотидную последовательность, так и сам праймер. Бесплатный инструмент NCBI Primer-BLAST объединяет создание праймеров и поиск BLAST в одно приложение, как и коммерческие программные продукты, такие как ePrime и Beacon Designer. Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР (Электронная ПЦР ) может быть выполнено, чтобы помочь в разработке праймера, задавая температуры плавления, отжига и т. Д.
Многие онлайн-инструменты доступны бесплатно для дизайна праймеров, некоторые из которых сосредоточены на конкретных приложениях ПЦР. Популярные инструменты Primer3Plus и PrimerQuest можно использовать для поиска праймеров, соответствующих широкому спектру спецификаций. Сильно вырожденные праймеры для нацеливания на широкий спектр ДНК-матриц можно интерактивно сконструировать с помощью GeneFISHER. Праймеры с высокой специфичностью для подмножества матриц ДНК в присутствии многих подобных вариантов могут быть созданы с использованием DECIPHER. Дизайн праймера направлен на достижение баланса между специфичностью и эффективностью амплификации.
Выбор конкретной области ДНК для связывания праймера требует некоторых дополнительных соображений. Следует избегать участков с высоким содержанием мононуклеотидных и динуклеотидных повторов, поскольку может происходить образование петель и вносить вклад в мешибридизацию. Грунтовки не должны легко отжигаться с другими грунтовками в смеси; это явление может привести к образованию продуктов «димера праймера», загрязняющих конечный раствор. Праймеры также не должны сильно отжигаться сами по себе, поскольку внутренние шпильки и петли могут препятствовать отжигу с матричной ДНК.
При конструировании праймеров дополнительные нуклеотидные основания могут быть добавлены к задним концам каждого праймера, что приводит к индивидуализированной кэп-последовательности на каждом конце амплифицированной области. Одним из применений этой практики является использование в клонировании ТА, специальной технике субклонирования, аналогичной ПЦР, где эффективность может быть увеличена путем добавления хвостов AG к концам 5 'и 3'.
В некоторых ситуациях может потребоваться использование вырожденных праймеров. Это смеси праймеров, которые похожи, но не идентичны. Это может быть удобно при амплификации одного и того же гена из разных организмов, поскольку последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, потому что сам генетический код является вырожденным, что означает, что несколько разных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту. Это позволяет различным организмам иметь существенно различающуюся генетическую последовательность, кодирующую очень похожий белок. По этой причине вырожденные праймеры также используются, когда конструкция праймера основана на последовательности белка, поскольку конкретная последовательность кодонов неизвестна. Следовательно, последовательность праймера, соответствующая аминокислоте изолейцину, может быть «ATH», где A означает аденин, T означает тимин, и H для аденина, тимина или цитозина в соответствии с генетическим кодом для каждого кодона, используя символы ИЮПАК для вырожденных оснований. Вырожденные праймеры могут не полностью гибридизоваться с последовательностью-мишенью, что может значительно снизить специфичность амплификации ПЦР.
Вырожденные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробной экологии. Они позволяют амплифицировать гены из пока еще некультивируемых микроорганизмов или позволяют извлекать гены из организмов, геномная информация которых недоступна. Обычно вырожденные праймеры конструируют путем выравнивания секвенирования генов, найденного в GenBank. Различия между последовательностями объясняются с использованием вырожденности IUPAC для отдельных оснований. Затем синтезируют праймеры для ПЦР как смесь праймеров, соответствующих всем перестановкам кодонной последовательности.
