генотипирование SNP

редактировать

Генотипирование SNP - это измерение генетических вариаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) между членами вид. Это форма генотипирования, которая является измерением более общей генетической изменчивости. SNP - один из наиболее распространенных типов генетической изменчивости. SNP - это мутация одной пары оснований в конкретном локусе, обычно состоящая из двух аллелей (где частота редких аллелей составляет>1%). Установлено, что SNP вовлечены в этиологию многих заболеваний человека и вызывают особый интерес в фармакогенетике. Поскольку SNP сохраняются в процессе эволюции, они были предложены в качестве маркеров для использования в анализе локусов количественных признаков (QTL ) и в ассоциативных исследованиях вместо микросателлитов. Использование SNP расширяется в проекте HapMap, целью которого является предоставление минимального набора SNP, необходимого для генотипирования генома человека. SNP также могут предоставить генетический отпечаток пальца для использования при проверке личности. Повышение интереса к SNP отразилось на бурном развитии разнообразных методов генотипирования SNP.

Содержание

  • 1 Методы на основе гибридизации
    • 1.1 Динамическая аллель-специфическая гибридизация
    • 1.2 Молекулярные маяки
    • 1.3 Микроматрицы SNP
  • 2 Ферментные методы
    • 2.1 Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента
    • 2.2 Методы на основе ПЦР
    • 2.3 Эндонуклеаза лоскута
    • 2.4 Удлинение праймера
    • 2,5 5'-нуклеаза
    • 2.6 Анализ лигирования олигонуклеотидов
  • 3 Другие методы постамплификации, основанные на физических свойствах ДНК
    • 3.1 Одноцепочечный конформационный полиморфизм
    • 3.2 Гель-электрофорез в температурном градиенте
    • 3.3 Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография
    • 3.4 Плавление всего ампликона с высоким разрешением
    • 3.5 Использование белков, связывающих несовпадение ДНК
    • 3.6 SNPlex
    • 3.7 Анализ нуклеаз Surveyor
  • 4 Секвенирование
  • 5 Ссылки
  • 6 Дополнительная литература
  • 7 Внешние ссылки

Методы на основе гибридизации

Было разработано несколько приложений, которые опросить SNP путем гибридизации зондов комплементарной ДНК с сайтом SNP. Задача этого подхода - снизить перекрестную гибридизацию между аллель-специфическими зондами. Эту проблему обычно преодолевают путем изменения условий жесткости гибридизации.

Динамическая аллель-специфическая гибридизация

SNP-Dash-1updated.png

Динамическое аллель-специфическая гибридизация (DASH). Генотипирование использует преимущества различий в температуре плавления ДНК, которые возникают в результате нестабильность несовпадающих пар оснований. Этот процесс можно значительно автоматизировать, и он включает несколько простых принципов.

На первом этапе геномный сегмент амплифицируется и присоединяется к шарику посредством реакции ПЦР с биотинилированным праймером. На втором этапе амплифицированный продукт присоединяют к колонке с стрептавидином и промывают NaOH для удаления небиотинилированной цепи. Затем добавляют аллель-специфический олигонуклеотид в присутствии молекулы, которая флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК. Затем измеряют интенсивность по мере увеличения температуры до тех пор, пока не может быть определена температура плавления (Tm) . SNP приведет к более низкой, чем ожидалось, Tm.

Поскольку генотипирование DASH измеряет поддающееся количественной оценке изменение Tm, оно способно измерять все типы мутаций, а не только SNP. Другие преимущества DASH включают возможность работы с датчиками без этикеток, а также простую конструкцию и рабочие условия.

Молекулярные маяки

SNP-Molecularprobe-1.png

Для обнаружения SNP с помощью молекулярных маяков используется специально сконструированный одноцепочечный олигонуклеотидный зонд. Олигонуклеотид сконструирован таким образом, что есть комплементарные области на каждом конце и последовательность зонда, расположенная между ними. Такая конструкция позволяет зонду принимать структуру шпильки или стержня-петли в естественном изолированном состоянии. К одному концу зонда прикреплен флуорофор, а к другому - гаситель флуоресценции. Из-за структуры зонда «стержень-петля» флуорофор находится в непосредственной близости от гасителя, что предотвращает излучение флуоресценции молекулой. Молекула также сконструирована таким образом, что только последовательность зонда комплементарна геномной ДНК, которая будет использоваться в анализе (Abravaya et al. 2003).

Если последовательность зонда молекулярного маяка встречает свою геномную ДНК-мишень во время анализа, она отжигается и гибридизуется. Из-за длины последовательности зонда шпилька зонда будет денатурирована в пользу образования более длинного и стабильного гибрида зонд-мишень. Это конформационное изменение позволяет флуорофору и тушителю быть свободными от их тесной близости из-за ассоциации шпильки, позволяя молекуле флуоресцировать.

Если, с другой стороны, последовательность зонда встречает последовательность-мишень всего с одним некомплементарным нуклеотидом, молекулярный маяк будет предпочтительно оставаться в своем естественном состоянии шпильки, и флуоресценция не будет наблюдаться, поскольку флуорофор остается закаленным.

SNP-Molecularprobe-2.png

Уникальный дизайн этих молекулярных маяков позволяет с помощью простого диагностического анализа идентифицировать SNP в заданном месте. Если молекулярный маяк предназначен для сопоставления аллеля дикого типа, а другой - для сопоставления мутантного аллеля, эти два могут использоваться для идентификации генотипа человека. Если во время анализа определяется только длина волны флуорофора первого зонда, то индивид гомозиготен к дикому типу. Если определяется только длина волны второго зонда, то человек гомозиготен по мутантному аллелю. Наконец, если обе длины волны обнаружены, то оба молекулярных маяка должны гибридизоваться со своими комплементами, и, следовательно, индивидуум должен содержать оба аллеля и быть гетерозиготным.

Микромассивы SNP

В массивах SNP олигонуклеотидов с высокой плотностью сотни тысяч зондов размещены на небольшом чипе, что позволяет опрашивать множество SNP одновременно. Поскольку аллели SNP различаются только одним нуклеотидом и поскольку трудно достичь оптимальных условий гибридизации для всех зондов в массиве, целевая ДНК может гибридизоваться с несовпадающими зондами. Отчасти это решается путем использования нескольких избыточных зондов для опроса каждого SNP. Зонды предназначены для того, чтобы иметь сайт SNP в нескольких разных местах, а также содержать несоответствия с аллелем SNP. Сравнивая разную степень гибридизации целевой ДНК с каждым из этих избыточных зондов, можно определить конкретные гомозиготные и гетерозиготные аллели. Хотя микроматрицы олигонуклеотидов имеют сравнительно более низкую специфичность и чувствительность, масштаб SNP, которые можно исследовать, является большим преимуществом. Affymetrix Human SNP 5.0 GeneChip выполняет общегеномный анализ, позволяющий генотипировать более 500 000 человеческих SNP (Affymetrix 2007).

Ферментные методы

Использовался широкий спектр ферментов, включая ДНК-лигазу, ДНК-полимеразу и нуклеазы. для создания высокоточных методов генотипирования SNP.

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) считается самым простым и самым ранним методом обнаружения SNP. SNP-RFLP использует множество различных эндонуклеаз рестрикции и их высокое сродство к уникальным и специфическим сайтам рестрикции. Выполняя расщепление геномного образца и определяя длину фрагментов с помощью гель-анализа, можно установить, разрезают ли ферменты ожидаемые сайты рестрикции. Неспособность разрезать геномный образец приводит к получению идентифицируемого более крупного, чем ожидалось, фрагмента, что означает наличие мутации в точке сайта рестрикции, обеспечивающей защиту от нуклеазной активности.

К сожалению, сочетание факторов высокой сложности большинства эукариотических геномов, потребности в конкретных эндонуклеазах, того факта, что точная мутация не может быть обязательно устранена в одном эксперименте, и медленный характер гель-анализов делают ПДРФ плохой выбор для высокопроизводительного анализа.

Методы на основе ПЦР

Система устойчивых мутаций для амплификации тетра-праймеров. ПЦР, или ARMS-PCR, использует две пары праймеров для амплификации двух аллелей в одной реакции ПЦР. Праймеры сконструированы таким образом, что две пары праймеров перекрываются в месте расположения SNP, но каждая идеально соответствует только одному из возможных SNP. Основа изобретения заключается в том, что неожиданно олигонуклеотиды с несовпадающим 3'-остатком не будут функционировать в качестве праймеров в ПЦР в соответствующих условиях. В результате, если данный аллель присутствует в реакции ПЦР, пара праймеров, специфичная для этого аллеля, будет производить продукт, но не для альтернативного аллеля с другим SNP. Две пары праймеров также сконструированы таким образом, что их продукты ПЦР имеют существенно разную длину, что позволяет легко различать полосы с помощью гель-электрофореза или анализа температуры плавления. При изучении результатов, если геномный образец является гомозиготным, то продукты ПЦР, которые будут получены в результате, будут от праймера, который соответствует положению SNP, и внешнего праймера противоположной цепи, а также от двух внешних праймеров. Если геномный образец является гетерозиготным, то продукты будут происходить из праймера каждого аллеля и их соответствующих аналогов внешних праймеров, а также внешних праймеров.

Альтернативная стратегия заключается в проведении нескольких реакций кПЦР с разными наборами праймеров, нацеленных на каждый аллель отдельно. Хорошо сконструированные праймеры будут амплифицировать их целевой SNP на гораздо более раннем цикле, чем другие SNP. Это позволяет различать более двух аллелей, хотя для каждого SNP требуется индивидуальная реакция qPCR. Для достижения достаточно высокой специфичности последовательность праймера может потребовать размещения искусственного несоответствия рядом с его 3'-концом, что представляет собой подход, широко известный как Taq-MAMA.

Эндонуклеаза лоскута

SNP- invader-1.jpg

Эндонуклеаза лоскута (FEN) - эндонуклеаза, катализирующая структурно-специфическое расщепление. Это расщепление очень чувствительно к несовпадениям и может использоваться для исследования SNP с высокой степенью специфичности

В основном, FEN, называемый расщеплением, комбинируется с двумя специфическими олигонуклеотидными зондами, которые вместе с целевой ДНК могут образуют трехчастную структуру, распознаваемую расщеплением. Первый зонд, называемый олигонуклеотидом Invader, комплементарен 3’-концу целевой ДНК. Последнее основание олигонуклеотида Invader представляет собой несовпадающее основание, которое перекрывает нуклеотид SNP в целевой ДНК. Второй зонд представляет собой аллель-специфический зонд, который комплементарен 5’-концу целевой ДНК, но также простирается за 3’-сторону нуклеотида SNP. Аллель-специфический зонд будет содержать основание, комплементарное нуклеотиду SNP. Если целевая ДНК содержит желаемый аллель, зонды Invader и аллель-специфичные пробы будут связываться с целевой ДНК, образуя трехчастную структуру. Эта структура распознается расщеплением, которое расщепляет и высвобождает 3 ’конец аллель-специфичного зонда. Если нуклеотид SNP в целевой ДНК не комплементарен аллель-специфичному зонду, правильная трехчастная структура не образуется и расщепление не происходит. Анализ Invader обычно сочетается с системой резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) для обнаружения события расщепления. В этой установке молекула гасителя прикреплена к 3 ’концу, а флуорофор прикреплен к 5’ концу аллель-специфического зонда. Если происходит расщепление, флуорофор будет отделен от молекулы гасителя, генерируя детектируемый сигнал.

Только минимальное расщепление происходит с несовпадающими зондами, что делает анализ Invader высокоспецифичным. Однако в исходном формате только один аллель SNP мог быть опрошен на образец реакции, и для генерации детектируемого сигнала в разумные сроки требовалось большое количество целевой ДНК. Несколько разработок расширили исходный анализ Invader . Выполняя вторичные реакции расщепления FEN, (SISAR) позволяет опрашивать оба аллеля SNP в одной реакции. Анализ SISAR Invader также требует меньшего количества целевой ДНК, что повышает чувствительность исходного анализа Invader . Анализ также был адаптирован несколькими способами для использования в формате с высокой пропускной способностью. На одной платформе аллель-специфические зонды прикреплены к микросферам. Когда расщепление FEN генерирует детектируемый флуоресцентный сигнал, сигнал измеряется с помощью проточной цитометрии. Чувствительность проточной цитометрии устраняет необходимость в ПЦР-амплификации целевой ДНК (Rao et al. 2003). Эти высокопроизводительные платформы не продвинулись дальше стадии подтверждения принципа, и до сих пор система Invader не использовалась ни в каких крупномасштабных проектах генотипирования SNP.

Расширение праймера

Удлинение праймера - это двухэтапный процесс, который сначала включает гибридизацию зонда с основаниями непосредственно перед нуклеотидом SNP с последующей реакцией «мини-секвенирования», в которой ДНК-полимераза удлиняет гибридизированный праймер путем добавления основания. который комплементарен нуклеотиду SNP. Это встроенное основание обнаруживается и определяет аллель SNP (Goelet et al. 1999; Syvanen 2001). Поскольку удлинение праймера основано на использовании высокоточного фермента ДНК-полимеразы, этот метод обычно очень надежен. Удлинение праймера способно генотипировать большинство SNP в очень похожих условиях реакции, что делает его также очень гибким. Метод удлинения праймера используется в нескольких форматах анализа. В этих форматах используется широкий спектр методов обнаружения, включая MALDI-TOF Mass Spectrometry (см. Sequenom ) и ELISA -подобные методы.

Как правило, существует два основных подхода, в которых используется включение либо флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (ddNTP), либо флуоресцентно меченных дезоксинуклеотидов (dNTP). С ddNTP зонды гибридизуются с целевой ДНК непосредственно перед нуклеотидом SNP, и один ddNTP, комплементарный аллелю SNP, добавляется к 3'-концу зонда (отсутствующий 3'-гидроксил в дидиоксинуклеотиде предотвращает добавление дополнительных нуклеотидов.). Каждый ddNTP помечен разными флуоресцентными сигналами, что позволяет обнаруживать все четыре аллеля в одной реакции. В случае dNTP аллель-специфические зонды имеют 3 ’основания, комплементарные каждому из опрашиваемых аллелей SNP. Если целевая ДНК содержит аллель, комплементарный 3 ’основанию зонда, целевая ДНК будет полностью гибридизоваться с зондом, позволяя ДНК-полимеразе распространяться от 3’ конца зонда. Это обнаруживается по включению флуоресцентно меченых дНТФ на конец зонда. Если целевая ДНК не содержит аллель, комплементарный 3 ’основанию зонда, целевая ДНК будет давать несоответствие на 3’ конце зонда, и ДНК-полимераза не сможет распространяться от 3 ’конца зонда. Преимущество второго подхода состоит в том, что несколько меченых дНТФ могут включаться в растущую цепь, что обеспечивает усиление сигнала. Однако в некоторых редких случаях ДНК-полимераза может происходить от несовпадающих 3 'зондов, давая ложноположительный результат.

Другой подход используется в методе генотипирования iPLEX SNP Sequenom, который использует масс-спектрометр MassARRAY. Зонды удлинения разработаны таким образом, что 40 различных анализов SNP могут быть амплифицированы и проанализированы в коктейле ПЦР. В реакции удлинения используются ddNTP, как указано выше, но обнаружение аллеля SNP зависит от фактической массы продукта удлинения, а не от флуоресцентной молекулы. Этот метод предназначен для низкой или средней производительности и не предназначен для сканирования всего генома.

Гибкость и специфичность удлинения праймера делают его пригодным для высокопроизводительного анализа. Зонды удлинения праймера могут быть расположены на предметных стеклах, что позволяет генотипировать сразу несколько SNP. Эта технология, широко известная как матричное удлинение праймеров (APEX), имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, основанными на дифференциальной гибридизации зондов. Для сравнения, методы APEX обладают большей различающей способностью, чем методы, использующие эту дифференциальную гибридизацию, поскольку часто невозможно получить оптимальные условия гибридизации для тысяч зондов на ДНК-микрочипах (обычно это решается за счет наличия зондов с высокой избыточностью). Однако такая же плотность зондов не может быть достигнута в методах APEX, что приводит к более низкому выходу за цикл.

Анализ Infinium компании Illumina Incorporated представляет собой пример конвейера полногеномного генотипирования, который на основе метода удлинения праймеров. В анализе Infinium можно генотипировать более 100 000 SNP. В этом анализе используются нуклеотиды, меченные гаптеном, в реакции удлинения праймера. Метка гаптена распознается антителами, которые, в свою очередь, связаны с обнаруживаемым сигналом (Gunderson et al. 2006).

- это метод генотипирования с использованием матричного удлинения праймеров, который позволяет параллельно идентифицировать сотни SNP или мутаций с использованием эффективной гомогенной мультиплексной ПЦР (до 640 сплетений) и четырехцветного одноосновного удлинения на микрочип. Мультиплексная ПЦР требует двух олигонуклеотидов на каждый SNP / мутацию, генерирующую ампликоны, содержащие тестируемую пару оснований. Те же олигонуклеотиды используются на следующем этапе в качестве иммобилизованных одноосновных праймеров для удлинения на микроматрице (Krjutskov et al. 2008).

5’-нуклеаза

5’-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq используется в анализе TaqMan для генотипирования SNP. Анализ TaqMan проводят одновременно с реакцией ПЦР, и результаты можно считывать в режиме реального времени по мере протекания реакции ПЦР (McGuigan Ralston 2002). Для анализа требуются прямые и обратные праймеры для ПЦР, которые будут амплифицировать область, включающую полиморфный сайт SNP. Распознавание аллелей достигается с использованием FRET в сочетании с одним или двумя аллель-специфическими зондами, которые гибридизуются с полиморфным сайтом SNP. Зонды будут иметь флуорофор, связанный с их 5 ’концом, и молекулу гасителя, связанную с их 3’ концом. Пока зонд не поврежден, гаситель будет оставаться в непосредственной близости от флуорофора, устраняя сигнал флуорофора. На этапе амплификации ПЦР, если аллель-специфический зонд полностью комплементарен аллелю SNP, он будет связываться с цепью ДНК-мишени и затем разрушаться 5'-нуклеазной активностью полимеразы Taq, поскольку она расширяет ДНК из ПЦР. грунтовки. Разложение зонда приводит к отделению флуорофора от молекулы гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал. Если аллель-специфический зонд не является полностью комплементарным, он будет иметь более низкую температуру плавления и связываться не так эффективно. Это предотвращает действие нуклеазы на зонд (McGuigan Ralston 2002).

Поскольку анализ TaqMan основан на ПЦР, его относительно просто реализовать. Анализ TaqMan можно объединить, объединив обнаружение до семи SNP в одной реакции. Однако, поскольку для каждого SNP требуется отдельный зонд, анализ TaqMan ограничен тем, насколько близко могут быть расположены SNP. Масштаб анализа можно резко увеличить, выполняя множество одновременных реакций в микротитровальных планшетах. Обычно TaqMan ограничивается приложениями, которые включают опрос небольшого числа SNP, поскольку для каждого SNP должны быть разработаны оптимальные зонды и условия реакции (Syvanen 2001).

Анализ лигирования олигонуклеотидов

ДНК-лигаза катализирует лигирование 3'-конца фрагмента ДНК с 5'-концом непосредственно прилегающего фрагмента ДНК. Этот механизм можно использовать для опроса SNP путем гибридизации двух зондов непосредственно над полиморфным сайтом SNP, в результате чего может происходить лигирование, если зонды идентичны целевой ДНК. В анализе олигонуклеотидной лигазы сконструированы два зонда; аллель-специфический зонд, который гибридизуется с целевой ДНК, так что его 3'-основание расположено непосредственно над нуклеотидом SNP, и второй зонд, который гибридизирует матрицу выше (ниже в комплементарной цепи) полиморфного сайта SNP, обеспечивая 5'-конец для реакции лигирования. Если аллель-специфический зонд совпадает с целевой ДНК, он полностью гибридизуется с целевой ДНК, и может произойти лигирование. Лигирование обычно не происходит в присутствии несоответствующего 3'-основания. Лигированные или нелигированные продукты могут быть обнаружены гель-электрофорезом, масс-спектрометрией MALDI-TOF или капиллярным электрофорезом для крупномасштабных приложений. С соответствующими последовательностями и метками на олигонуклеотидах можно получить высокопроизводительные данные о последовательностях из лигированных продуктов и определенных генотипов (Curry et al., 2012). Использование большого количества индексов выборки позволяет сгенерировать данные последовательности с высокой пропускной способностью для сотен SNP в тысячах выборок за небольшую часть цикла высокопроизводительного секвенирования. Это массовое генотипирование с помощью технологии секвенирования (MGST).

Другие методы постамплификации, основанные на физических свойствах ДНК

Характерные свойства ДНК в виде температуры плавления и однонитевой конформации использовались в нескольких приложениях для различения аллелей SNP. Эти методы очень часто достигают высокой специфичности, но требуют высоко оптимизированных условий для получения наилучших возможных результатов.

Полиморфизм однонитевой конформации

Одноцепочечная ДНК (оцДНК) складывается в третичную структуру. Конформация зависит от последовательности, и большинство мутаций одной пары оснований изменяют форму структуры. При нанесении на гель третичная форма будет определять подвижность оцДНК, обеспечивая механизм различения аллелей SNP. Этот метод сначала включает ПЦР-амплификацию целевой ДНК. Двухцепочечные продукты ПЦР денатурируют с использованием тепла и формальдегида для получения оцДНК. ОцДНК наносят на неденатурирующий гель для электрофореза и дают возможность свернуться в третичную структуру. Различия в последовательности ДНК изменяют третичную конформацию и обнаруживаются как разница в подвижности цепи оцДНК (Costabile et al. 2006). Этот метод широко используется, поскольку он технически прост, относительно недорог и требует использования общедоступного оборудования. Однако по сравнению с другими методами генотипирования SNP чувствительность этого анализа ниже. Было обнаружено, что конформация оцДНК сильно зависит от температуры, и, как правило, не очевидно, какова идеальная температура. Очень часто анализ будет проводиться с использованием нескольких различных температур. Также существует ограничение на длину фрагмента, потому что чувствительность падает, когда используются последовательности длиннее 400 п.н. (Costabile et al. 2006).

Гель-электрофорез в температурном градиенте

SNP-DHPLC-TGGE- 1updated.jpg

Метод гель-электрофореза в температурном градиенте (TGGE) или капиллярного электрофореза в температурном градиенте (TGCE) основан на принципе, согласно которому частично денатурированная ДНК более ограничена и перемещается медленнее в пористом материале, таком как гель. Это свойство позволяет разделять ДНК по температуре плавления. Чтобы адаптировать эти методы для обнаружения SNP, используются два фрагмента; ДНК-мишень, которая содержит исследуемый полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем повторно отжигают. Если целевая ДНК имеет тот же аллель, что и нормальный фрагмент, образуются гомодуплексы с одинаковой температурой плавления. При работе на геле с градиентом температуры появится только одна полоса. Если целевая ДНК имеет отдельный аллель, после стадии повторного отжига образуются четыре продукта; гомодуплексы, состоящие из целевой ДНК, гомодуплексы, состоящие из нормальной ДНК, и два гетеродуплекса каждой цепи целевой ДНК, гибридизованные с нормальной цепью ДНК. Эти четыре продукта будут иметь различные температуры плавления и будут отображаться в виде четырех полос в денатурирующем геле.

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC) использует обращенно-фазовую ВЭЖХ для опроса SNP. Ключ к DHPLC - это твердая фаза, которая имеет дифференциальное сродство к одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. В DHPLC фрагменты ДНК денатурируют нагреванием, а затем дают возможность повторно отожиться. Температура плавления повторно отожженных фрагментов ДНК определяет продолжительность времени, в течение которого они остаются в колонке. Используя ПЦР, генерируют два фрагмента; ДНК-мишень, содержащая полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Этот нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем дают возможность постепенно реанимировать. Реантированные продукты добавляют в колонку DHPLC. Если аллель SNP в целевой ДНК совпадает с нормальным фрагментом ДНК, только идентичные гомодуплексы будут формироваться во время стадии повторного отжига. Если целевая ДНК содержит аллель SNP, отличный от нормального фрагмента ДНК, в дополнение к гомодуплексам будут образовываться гетеродуплексы целевой ДНК и нормальной ДНК, содержащие несовпадающий полиморфный сайт. Несоответствующие гетеродуплексы будут иметь другую температуру плавления, чем гомодуплексы, и не будут удерживаться в колонке так долго. Это генерирует хроматографический образец, который отличается от образца, который был бы сгенерирован, если бы целевой фрагмент ДНК и нормальные фрагменты ДНК были идентичны. Элюированную ДНК детектируют по УФ-поглощению.

DHPLC легко автоматизировать, поскольку не требуется мечение или очистка фрагментов ДНК. Этот метод также относительно быстр и отличается высокой специфичностью. Одним из основных недостатков DHPLC является то, что температура колонки должна быть оптимизирована для каждой цели, чтобы достичь нужной степени денатурации.

Плавление всего ампликона с высоким разрешением

Анализ плавления с высоким разрешением это самый простой для понимания метод, основанный на ПЦР. По сути, здесь и в реальном времени применяются те же термодинамические свойства, которые позволили гелевым методам работать. Флуориметр отслеживает денатурацию всего ампликона дцДНК после ПЦР. Вы делаете праймеры, специфичные для сайта, который хотите амплифицировать. Вы «окрашиваете» ампликон двухцепочечным специфическим красителем, включенным в смесь для ПЦР. Краситель, специфичный для ds, интегрируется в продукт ПЦР. По сути, весь ампликон становится зондом. Это открывает новые возможности для открытий. Либо вы размещаете праймеры очень близко по обе стороны от рассматриваемого SNP (генотипирование малых ампликонов, Liew, 2004), либо амплифицируете более крупную область (длиной 100-400 п.н.) для целей сканирования. Для простого генотипирования SNP проще сделать ампликон маленьким, чтобы свести к минимуму вероятность того, что вы перепутаете один SNP с другим. Определяют температуру плавления (Tm) всего ампликона, и большинство гомозигот достаточно отличаются (в лучших инструментах) по Tm от генотипа. Гетерозиготы еще легче дифференцировать, потому что они генерируют гетеродуплексы (см. Объяснения на основе геля), которые расширяют переход расплава и обычно дают два различимых пика. Было описано плавление ампликона с использованием флуоресцентно меченого праймера (Gundry et al., 2003), но оно менее практично, чем использование ds-специфичных красителей из-за стоимости флуорогенного праймера.

Сканирование больших ампликонов основано на тех же принципах, что указаны выше. Однако информативными становятся температура плавления и общая форма кривой плавления. Для ампликонов>c.150 п.н. часто имеется>2 пика плавления, каждый из которых может варьироваться в зависимости от состава матрицы ДНК. Многочисленные исследователи смогли успешно устранить большую часть своего секвенирования с помощью сканирования на основе расплава, что позволило точно определить генотипирование на основе локуса большого числа людей. Многие исследователи обнаружили, что сканирование мутаций с использованием плавления с высоким разрешением является жизнеспособным и практичным способом изучения целых генов.

Использование белков, связывающих несовпадение ДНК.

Белки, связывающие несовпадения ДНК, могут различать единичные нуклеотидные несовпадения и, таким образом, облегчать дифференциальный анализ SNP. Например, белок MutS из Thermus aquaticus связывает разные однонуклеотидные несовпадения с разным сродством и может использоваться в капиллярном электрофорезе для дифференциации всех шести наборов несовпадений (Drabovich Krylov 2006).

SNPlex

SNPlex - это запатентованная платформа для генотипирования, продаваемая Applied Biosystems.

Surveyor Nuclease Assay

Surveyor нуклеаза - это фермент эндонуклеазы несоответствия, который распознает все замены оснований и небольшие вставки / делеции (инделки), и расщепляет 3'-сторону несовпадающих сайтов в обеих цепях ДНК.

Секвенирование

Технологии секвенирования следующего поколения, такие как пиросеквенирование последовательности менее 250 оснований в считывании, что ограничивает их способность секвенировать целые геномы. Тем не менее, их способность генерировать результаты в режиме реального времени и их потенциал для массового масштабирования делает их жизнеспособным вариантом для секвенирования небольших областей для выполнения генотипирования SNP. По сравнению с другими методами генотипирования SNP, секвенирование, в частности, подходит для идентификации нескольких SNP в небольшой области, такой как высокополиморфная область генома Major Histocompatibility Complex.

Ссылки

Дополнительная литература

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-06 03:58:57
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте