Войти
Illumina Methylation Assay с использованием Infinium I платформа использует технологию BeadChip для генерации комплексного профиля генома по всему человеческому метилированию ДНК. Подобно бисульфитному секвенированию и пиросеквенированию, этот метод определяет количественно уровни метилирования в различных локусах в геноме. Этот анализ используется для зондов метилирования на чипе Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (далее 27k [метилирование]). Зонды на 27k целевых областях массива генома человека для измерения уровней метилирования 27 578 динуклеотидов CpG в 14 495 генах. Массив Infinium HumanMethylation450 BeadChip нацелен на>450 000 сайтов метилирования.
Метилирование ДНК играет значительную роль в эпигенетической регуляции структуры хроматина, которая в последнем Десятилетие было признано важным в регуляции экспрессии генов, развития и генетического импринтинга у позвоночных. Было показано, что изменения в характере и уровне метилирования способствуют раку и различным заболеваниям развития. Например, гиперметилирование на промоторных CpG-островках гена-супрессора опухоли, которое, в свою очередь, приводит к его подавлению, часто связано с опухолевым генезом. Крупномасштабное измерение паттернов метилирования ДНК из широкого выбора генов может позволить нам лучше понять взаимосвязь между эпигенетическими изменениями и генезом различных заболеваний и лучше понять роль, которую эпигенетика играет в тканевой специфичности. дифференциация.
Таблица 1. Статистика метилирования Чип метилирования Illumina 27k содержит 27 578 отдельных сайтов CpG, распределенных по 14 495 генам. Эти гены включают гены RefSeq из базы данных NCBI CCDS, гены рака, которые демонстрируют различные паттерны метилирования во время своего развития, и промоторы микроРНК. Маркеры, включенные в чип, приведены в таблице 1.
Рисунок 1. Рабочий процесс анализа Infinium I. Один чип BeadChip вмещает 12 образцов. Здесь изображена только одна цепь в (одном) локусе (соответствующая, например, одной и той же цепи, материнской и отцовской копий у диплоидного индивида, который является гетерозиготным по метилированию в этом конкретном локусе). В этом примере удлинение на одно основание было успешным для двух дидезоксинуклеотидов, содержащих аденин, соответствующих одному метилированному и одному неметилированному аллелю в исходном (т.е. до превращения бисульфита) геноме. Для технологии химического анализа Infinium I процесс показано на рисунке 1.. Обработка бисульфитом . Приблизительно 1 мкг геномной ДНК используется в превращении бисульфита для превращения неметилированного цитозина в урацил. Продукт содержит непревращенный цитозин там, где они были ранее метилированы, но цитозин преобразован в урацил, если они ранее не были метилированы.
Амплификация цельной геномной ДНК . ДНК, обработанная бисульфитом, подвергается (WGA) с помощью случайного гексамерного праймирования и Phi29 ДНК-полимеразы, которая обладает активностью проверки, приводящей к 100-кратному количеству ошибок ниже, чем у полимеразы Taq. Затем продукты ферментативно фрагментируются, очищаются от дНТФ, праймеров и ферментов и наносятся на чип.
Гибридизация и одноосновное удлинение . На чипе есть два типа гранул для каждого CpG (или «CG», как показано на фиг. 1) сайт на локус. Каждый тестируемый локус отличается по типу гранул. Оба типа бусинок присоединены к одноцепочечной 50-мерной ДНК олигонуклеотидам, которые отличаются последовательностью только на свободном конце; зонд этого типа известен как аллель-специфический олигонуклеотид. Один из типов гранул будет соответствовать метилированному цитозиновому локусу, а другой - неметилированному цитозиновому локусу, который был преобразован в урацил во время обработки бисульфитом и позже амплифицирован в виде тимина во время амплификации всего генома. Продукты амплифицированной ДНК, преобразованные бисульфитом, денатурируют в отдельные цепи и гибридизуют с чипом посредством аллель-специфичного отжига либо с зондом, специфичным для метилирования, либо с зондом, не являющимся метилированным. За гибридизацией следует одноосновное удлинение с помощью меченных гаптеном дидезоксинуклеотидов. DdCTP и ddGTP помечены биотином, а ddATP и ddUTP помечены 2,4-динитрофенолом (DNP).
Флуоресцентное окрашивание и сканирование чипа . После включения этих меченных гаптеном ддНТФ проводят многослойные иммуногистохимические анализы путем повторных циклов окрашивания комбинацией антител для дифференциации двух типов. После окрашивания чип сканируется, чтобы показать интенсивности неметилированных и метилированных гранул. (Фигура 2). Исходные данные анализируются запатентованным программным обеспечением, и рассчитываются отношения интенсивности флуоресценции между двумя типами гранул. Для данного индивида в данном локусе значение отношения 0 равно неметилированию локуса (т.е. гомозиготно неметилировано); соотношение 1 соответствует общему метилированию (т.е. гомозиготному метилированию); а значение 0,5 означает, что одна копия метилирована, а другая нет (т.е. гетерозиготна) в диплоидном геноме человека.
Рисунок 2. Типы анализа данных. Анализ данных метилирования . Отсканированные изображения микроматрицы данных метилирования далее анализируются системой, которая нормализует необработанные данные, чтобы уменьшить влияние экспериментальной вариации, фоновой и средней нормализации, и выполняет стандартные статистические тесты по результатам. Затем данные можно объединить в несколько типов фигур для визуализации и анализа. Диаграммы разброса используются для корреляции данных метилирования; гистограммы для визуализации относительных уровней метилирования на каждом тестируемом сайте; тепловые карты для кластеризации данных для сравнения профиля метилирования на протестированных сайтах. На рисунке 2 показаны различные типы полученных результатов.
Преимущества
Недостатки
