Войти
Подавление гена - это регулирование экспрессии гена в клетке для предотвращения экспрессии определенного ген. Подавление гена может происходить либо во время транскрипции, либо во время трансляции и часто используется в исследованиях. В частности, методы, используемые для подавления генов, все чаще используются для производства терапевтических средств для борьбы с раком и другими заболеваниями, такими как инфекционные заболевания и нейродегенеративные расстройства.
подавление гена - это часто считается тем же, что и нокдаун гена. Когда гены замалчиваются, их экспрессия снижается. Напротив, когда гены выключены, они полностью стираются из генома организма и, таким образом, не имеют экспрессии. Подавление гена считается механизмом нокдауна гена, поскольку методы, используемые для подавления генов, такие как РНКи, CRISPR или миРНК, обычно снижают экспрессию гена. не менее чем на 70%, но полностью не устранить. Методы, использующие сайленсинг генов, часто считаются лучшими, чем нокауты генов, поскольку они позволяют исследователям изучать основные гены, которые необходимы для выживания животных моделей и которые не могут быть удалены. Кроме того, они предоставляют более полное представление о развитии заболеваний, поскольку заболевания обычно связаны с генами, экспрессия которых снижена.
Антисмысловые олигонуклеотиды были открыты в 1978 году Полом Замечником и Мэри Стивенсон. Олигонуклеотиды, которые представляют собой короткие нуклеиновые кислоты Фрагменты связываются с комплементарными молекулами мРНК-мишени при добавлении в клетку. Эти молекулы могут состоять из одноцепочечной ДНК или РНК и обычно имеют длину 13-25 нуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды могут влиять на экспрессию генов двумя способами: с помощью механизма, зависимого от РНКазы H, или с помощью механизма стерического блокирования. РНКаза H-зависимые олигонуклеотиды вызывают разрушение целевых молекул мРНК, в то время как стерические блокаторы олигонуклеотиды предотвращают трансляцию молекулы мРНК. Большинство антисмысловых лекарств действует через РНКазу H-зависимый механизм, в котором РНКаза H гидролизует цепь РНК гетеродуплекса ДНК / РНК . Этот механизм считается более эффективным, приводя к снижению экспрессии белка и мРНК примерно на 80-95%.
Общий механизм, используемый рибозимами для расщепления молекул РНК Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, используемые для подавления экспрессии гена. Эти молекулы работают, расщепляя молекулы мРНК, по существу подавляя гены, которые их продуцируют. Сидни Альтман и Томас Чех впервые открыли каталитические молекулы РНК, РНКазы P и интронные рибозимы группы II в 1989 году и получили Нобелевскую премию за свое открытие. Существует несколько типов рибозимных мотивов, в том числе головка молотка, шпилька, вирус гепатита дельта, группа I, группа II и РНКазы P рибозимы. Рибозимные мотивы вируса «голова-молот», «шпилька» и дельта-вируса гепатита (HDV) обычно обнаруживаются в вирусах или вироидных РНК. Эти мотивы способны самостоятельно расщеплять специфическую фосфодиэфирную связь на молекуле мРНК. Низшие эукариоты и несколько бактерий содержат рибозимы группы I и группы II. Эти мотивы могут самосращиваться путем расщепления и соединения фосфодиэфирных связей. Последний мотив рибозима, рибозим РНКаза P, обнаружен в Escherichia coli и известен своей способностью расщеплять фосфодиэфирные связи нескольких предшественников тРНК при соединении с кофактором белка. 130>
Общий каталитический механизм, используемый рибозимами, аналогичен механизму, используемому белками рибонуклеазами. Эти каталитические молекулы РНК связываются с определенным сайтом и атакуют соседний фосфат в основной цепи РНК своим 2 'кислородом, который действует как нуклеофил, что приводит к образованию продуктов расщепления с 2'3'- циклический фосфат и 5'-концевой гидроксильный конец. Этот каталитический механизм все чаще используется учеными для выполнения последовательного расщепления целевых молекул мРНК. Кроме того, предпринимаются попытки использовать рибозимы для создания терапевтических средств, подавляющих гены, которые заставили бы замолчать гены, ответственные за вызывающие заболевания.
Слева: обзор РНК-интерференции. РНК-интерференция (РНКи ) - это естественный процесс, используемый клетками для регулирования экспрессии генов. Он был открыт в 1998 году Эндрю Файром и Крейгом Мелло, получившими Нобелевскую премию за свое открытие в 2006 году. Процесс подавления генов сначала начинается с появления двухцепочечная РНК (дцРНК) в клетку, которая запускает путь РНКи. Затем двухцепочечная молекула разрезается на небольшие двухцепочечные фрагменты ферментом под названием Dicer. Эти небольшие фрагменты, которые включают малые интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (миРНК), имеют длину приблизительно 21–23 нуклеотида. Фрагменты интегрируются в мультисубъединичный белок, называемый РНК-индуцированным комплексом сайленсинга, который содержит белки Argonaute, которые являются важными компонентами пути РНКи. Одна цепь молекулы, называемая «направляющей» цепью, связывается с RISC, в то время как другая цепь, известная как «цепь-пассажира», разрушается. Направляющая или антисмысловая цепь фрагмента, который остается связанным с RISC, направляет специфичное для последовательности молчание целевой молекулы мРНК. Гены могут подавляться молекулами миРНК, которые вызывают эндонуклеатическое расщепление целевых молекул мРНК, или молекулами миРНК, которые подавляют трансляцию молекулы мРНК. При расщеплении или репрессии трансляции молекул мРНК гены, которые их образуют, становятся практически неактивными. Считается, что РНКи эволюционировала как механизм клеточной защиты от захватчиков, таких как РНК-вирусы, или для борьбы с пролиферацией транспозонов в ДНК клетки. И РНК-вирусы, и транспозоны могут существовать в виде двухцепочечной РНК и приводить к активации РНКи. В настоящее время миРНК широко используются для подавления экспрессии специфических генов и для оценки функции генов. Компании, использующие этот подход, включают, среди прочего, Alnylam, Sanofi, Arrowhead, Discerna и Persomics.
Три первичных нетранслируемых области (3'UTR) матричных РНК (мРНК) часто содержат регуляторные последовательности, которые посттранскрипционно вызывают молчание генов. Такие 3'-UTR часто содержат как сайты связывания для микроРНК (miRNA), так и для регуляторных белков. Связываясь со специфическими сайтами в 3'-UTR, большое количество специфических miRNAs снижают экспрессию гена их конкретных мРНК-мишеней, либо ингибируя трансляцию, либо напрямую вызывая деградацию транскрипта, с использованием механизма, аналогичного РНК-интерференции (см. MicroRNA ). 3'-UTR также может иметь сайленсерные области, которые связывают репрессорные белки, которые ингибируют экспрессию мРНК.
3'-UTR часто содержит элементы ответа микроРНК (MRE). MRE - это последовательности, с которыми миРНК связываются и вызывают молчание генов. Это преобладающие мотивы в 3'-UTR. Среди всех регуляторных мотивов в 3'-UTR (например, включая области сайленсеров) MRE составляют около половины мотивов.
По состоянию на 2014 г. веб-сайт miRBase, архив последовательностей миРНК и аннотаций, перечислил 28 645 записей о 233 биологических видах. Из них 1881 miRNA находились в аннотированных локусах miRNA человека. Предполагалось, что каждая из miRNA будет иметь в среднем около четырехсот целевых мРНК (вызывающих молчание нескольких сотен генов). Freidman et al. подсчитали, что>45000 miRNA сайтов-мишеней в 3'UTR мРНК человека консервативны выше фоновых уровней, и>60% кодирующих белки человека генов находились под селективным давлением для поддержания спаривания с миРНК.
Прямые эксперименты показывают, что одна миРНК может снизить стабильность сотен уникальных мРНК. Другие эксперименты показывают, что одна миРНК может подавлять продукцию сотен белков, но эта репрессия часто бывает относительно мягкой (менее чем в 2 раза).
Эффекты дисрегуляции миРНК экспрессия генов, по-видимому, важна при раке. Например, при раке желудочно-кишечного тракта девять miRNA были идентифицированы как эпигенетически измененные и эффективные в подавлении регуляции ферментов репарации ДНК.
Эффекты дисрегуляции miRNA экспрессии генов также, по-видимому, важны для психоневрологические расстройства, такие как шизофрения, биполярное расстройство, большая депрессия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и расстройства аутистического спектра.
Методы подавления генов широко используются исследователями для изучения генов, связанных с расстройствами. Эти расстройства включают рак, инфекционные заболевания, респираторные заболевания и нейродегенеративные нарушения. В настоящее время подавление генов также используется в усилиях по открытию новых лекарств, таких как синтетическая летальность, высокопроизводительный скрининг и миниатюрные скрининги РНКи.
РНК-интерференция. был использован для подавления генов, связанных с несколькими видами рака. В in vitro исследованиях хронического миелогенного лейкоза (CML), siRNA использовалась для расщепления гибридного белка BCR-ABL, который предотвращает связывание препарата Гливек (иматиниб ) с раковыми клетками. Расщепление слитого белка снижает количество трансформированных кроветворных клеток, которые распространяются по всему телу, за счет повышения чувствительности клеток к лекарству. РНК-интерференция также может использоваться для нацеливания на определенные мутанты. Например, миРНК были способны специфически связываться с молекулами супрессора опухолей p53, содержащими единственную точечную мутацию, и разрушать ее, оставляя супрессор дикого типа нетронутым.
Рецепторы, участвующие в митогенных путях, которые приводят к увеличению производства раковых клеток, также являются мишенью для молекул миРНК. хемокиновый рецептор хемокиновый рецептор 4 (CXCR4), связанный с пролиферацией рака груди, расщеплялся молекулами миРНК, что уменьшало количество делений, обычно наблюдаемых раковыми клетками. Исследователи также использовали миРНК для избирательной регуляции экспрессии генов, связанных с раком. Антиапоптотические белки, такие как кластерин и сурвивин, часто экспрессируются в раковых клетках. Нацеленные на кластерин и сурвивин миРНК были использованы для уменьшения количества антиапоптотических белков и, таким образом, повышения чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическому лечению. Исследования in vivo также все чаще используются для изучения потенциального использования Молекулы миРНК в противораковых препаратах. Например, было обнаружено, что мыши, которым имплантированы клетки аденокарциномы толстой кишки, выживают дольше, если клетки предварительно обрабатывали миРНК, которые нацелены на B-катенин в раковые клетки.
Вирусные гены и гены-хозяева, которые необходимы вирусам для репликации или проникновения в клетку, или которые играют важную роль в жизненном цикле вируса, часто становятся мишенью противовирусной терапии. РНКи использовались для нацеливания на гены при нескольких вирусных заболеваниях, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатит. В частности, siRNA использовали, чтобы заставить замолчать первичный рецептор хемокина 5 (CCR5) рецептора ВИЧ. Это препятствовало проникновению вируса в лимфоциты периферической крови человека и первичные гемопоэтические стволовые клетки. Аналогичный метод был использован для уменьшения количества обнаруживаемого вируса в инфицированных клетках гепатита B и C. При гепатите B подавление siRNA использовалось для нацеливания поверхностного антигена на вирус гепатита B и приводило к уменьшению количества вирусных компонентов. Кроме того, методы siRNA, используемые при гепатите C, позволили снизить количество вируса в клетке на 98%.
РНК-интерференция уже более 20 лет используется в коммерческих целях для борьбы с вирусными заболеваниями растений (см. Устойчивость к болезням растений ). В 1986–1990 годах были опубликованы многочисленные примеры «устойчивости, опосредованной белком оболочки» к вирусам растений, до того как была обнаружена РНКи. В 1993 году работа с вирусом травления табака впервые продемонстрировала, что организмы-хозяева могут нацеливаться на конкретные последовательности вирусов или мРНК для деградации, и что эта активность является механизмом, лежащим в основе некоторых примеров устойчивости к вирусам у трансгенных растений. Открытие малых интерферирующих РНК (детерминанта специфичности в РНК-опосредованном сайленсинге генов) также использовало индуцированное вирусом посттранскрипционное молчание генов у растений. К 1994 г. были созданы трансгенные разновидности кабачков, экспрессирующие гены белков оболочки трех различных вирусов, что дало гибриды кабачков с проверенной полевой устойчивостью к поливирусным препаратам, которые остаются в коммерческом использовании в настоящее время. Линии картофеля, экспрессирующие последовательности вирусных репликаз, которые придают устойчивость к вирусу скручивания листьев картофеля, продавались под торговыми названиями NewLeaf Y и NewLeaf Plus и широко применялись в коммерческом производстве в 1999–2001 годах, пока McDonald's Corp. не решила не покупать GM картофель и Monsanto решили закрыть свой картофельный бизнес в NatureMark. Другой часто цитируемый пример устойчивости к вирусам, опосредованной замалчиванием генов, касается папайи, где гавайскую индустрию папайи спасли устойчивые к вирусам ГМ-папайи, произведенные и лицензированные университетскими исследователями, а не крупной корпорацией. Эти папайи также используются в настоящее время, хотя и не без значительного общественного протеста, что заметно менее очевидно в медицинских применениях подавления генов.
Методы подавления гена также использовались для нацеливания на другие вирусы, такие как вирус папилломы человека, вирус Западного Нила и вирус Тулейна. Ген Е6 в образцах опухолей, полученных от пациентов с вирусом папилломы человека, был мишенью и, как было установлено, вызывает апоптоз в инфицированных клетках. Плазмидные векторы экспрессии siRNA, используемые для нацеливания на вирус Западного Нила, также были способны предотвращать репликацию вирусов в клеточных линиях. Кроме того, было обнаружено, что миРНК успешно предотвращает репликацию вируса Тулейн, части вируса семейства Caliciviridae, воздействуя как на его структурные, так и на неструктурные гены. Путем воздействия на ген NTPase было показано, что одна доза siRNA за 4 часа до заражения контролирует репликацию вируса Тулейн в течение 48 часов после заражения, снижая вирусный титр до 2,6 логарифма. Хотя вирус Тулейн является видоспецифичным и не поражает людей, было показано, что он тесно связан с человеческим норовирусом, который является наиболее частой причиной острого гастроэнтерита и пищевые болезни вспышки в США. Человеческие норовирусы печально известны тем, что их трудно изучать в лаборатории, но вирус Тулейн предлагает модель для изучения этого семейства вирусов с клинической целью разработки методов лечения, которые могут использоваться для лечения заболеваний, вызванных человеческим норовирусом.
Структура типичной грамположительной бактериальной клетки В отличие от вирусов, бактерии не так восприимчивы к подавлению активности миРНК. Во многом это связано с тем, как размножаются бактерии. Бактерии размножаются вне клетки-хозяина и не содержат необходимых механизмов для функционирования РНКи. Однако бактериальные инфекции все еще можно подавлять с помощью миРНК, нацеливая гены хозяина, которые участвуют в иммунном ответе, вызванном инфекцией, или нацеливая гены хозяина, участвующие в опосредовании проникновения бактерий в клетки. Например, siRNA использовали для уменьшения количества провоспалительных цитокинов, экспрессируемых в клетках мышей, обработанных липополисахаридом (LPS). Снижение экспрессии воспалительного цитокина, фактора некроза опухоли α (TNFα), в свою очередь, вызывало снижение септического шока, испытываемого мышами, обработанными LPS. Кроме того, siRNA использовали для предотвращения проникновения бактерий Psueomonas aeruginosa в эпителиальные клетки легких мышей, подавляя ген кавеолина-2 (CAV2). Таким образом, хотя бактерии не могут быть напрямую нацелены на механизмы миРНК, они все же могут быть затронуты миРНК, когда нацелены на компоненты, участвующие в бактериальной инфекции.
Рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды и недавно РНКи были использованы для нацеливания на молекулы мРНК, участвующие в астме. Эти эксперименты показали, что siRNA можно использовать для борьбы с другими респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и кистозный фиброз. ХОБЛ характеризуется бокаловидно-клеточной гиперплазией и слизистой гиперсекрецией. Было обнаружено, что секреция слизи снижается, когда трансформирующий фактор роста (TGF) -α нацелился на siRNA в NCI-H292 человеческие дыхательные пути эпителиальные клетки. Помимо гиперсекреции слизи, для ХОБЛ и астмы характерны хроническое воспаление и повреждение легочной ткани. Считается, что трансформирующий фактор роста TGF-β играет роль в этих проявлениях. В результате, когда интерферон (IFN) -γ использовался для подавления TGF-β, фиброз легких, вызванный повреждением и рубцеванием легочной ткани, улучшился. 130>
Кристаллографическая структура N-концевой области белка гентингтина человека. Болезнь Хантингтона (HD) возникает в результате мутации в ген хантингтина, вызывающий избыток CAG-повторов. Затем ген образует мутированный белок хантингтина с полиглутаминовыми повторами около аминоконца. Это неизлечимое заболевание, вызывающее моторные когнитивные и поведенческие нарушения. Исследователи рассматривали молчание генов как потенциальное терапевтическое средство от HD.
Подавление гена может использоваться для лечения HD путем нацеливания на мутантный белок хантингтин. Мутантный белок хантингтин был нацелен на подавление аллель-специфичного гена с использованием аллель-специфичных олигонуклеотидов. В этом методе антисмысловые олигонуклеотиды используются для нацеливания на однонуклеотидный полиморфизм (SNP), которые представляют собой однонуклеотидные изменения в последовательности ДНК, поскольку было обнаружено, что пациенты с HD имеют общие SNP, которые связаны с мутировавшими аллель хантингтина. Было обнаружено, что примерно 85% пациентов с HD могут быть охвачены при нацеливании на три SNP. Кроме того, когда антисмысловые олигонуклеотиды использовались для нацеливания на HD-ассоциированный SNP у мышей, наблюдалось 50% снижение мутантного белка хантинтина.
Неаллельспецифическое подавление гена с использованием молекул миРНК также использовалось для заставить замолчать мутантные белки хантингтина. Благодаря этому подходу, вместо нацеливания SNP на мутировавший белок, нацелены все нормальные и мутированные белки хантингтина. При исследовании на мышах было обнаружено, что миРНК может снижать нормальный и мутантный уровни хантингтина на 75%. На этом уровне они обнаружили, что у мышей развился улучшенный моторный контроль и более высокая выживаемость по сравнению с контролем. Таким образом, методы сайленсинга генов могут оказаться полезными при лечении HD.
Боковой амиотрофический склероз (БАС), также называемый болезнью Лу Герига, представляет собой заболевание двигательных нейронов, которое поражает мозг и спинной мозг. Заболевание вызывает дегенерацию мотонейронов, что в конечном итоге приводит к гибели нейронов и мышечной дегенерации. Было обнаружено, что сотни мутаций в гене Cu / Zn супероксиддисмутазы (SOD1) вызывают БАС. Чтобы подавить мутант SOD1, характерный для БАС, использовали подавление гена. В частности, молекулы миРНК были успешно использованы для нацеливания на мутантный ген SOD1 и снижения его экспрессии за счет подавления аллель-специфичного гена.
Основной механизм, используемый вирусными векторами для доставки генов в клетки-мишени. Показанный пример представляет собой лентивирусный вектор. Существует несколько проблем, связанных с терапией подавления генов, включая доставку и специфичность для клеток-мишеней. Например, для лечения нейродегенеративных заболеваний молекулы для предполагаемой терапии подавления генов должны доставляться в мозг. гематоэнцефалический барьер затрудняет доставку молекул в мозг через кровоток, препятствуя прохождению большинства молекул, которые вводятся или всасываются в кровь. Таким образом, исследователи обнаружили, что они должны напрямую вводить молекулы или насосы-имплантаты, которые проталкивают их в мозг.
Однако, оказавшись внутри мозга, молекулы должны перемещаться внутри клеток-мишеней. Для эффективной доставки молекул миРНК в клетки можно использовать вирусные векторы. Тем не менее, этот способ доставки также может быть проблематичным, поскольку он может вызвать иммунный ответ против молекул. В дополнение к доставке было обнаружено, что специфичность также является проблемой для сайленсинга генов. Как антисмысловые олигонуклеотиды, так и молекулы миРНК могут потенциально связываться с неправильной молекулой мРНК. Таким образом, исследователи ищут более эффективные методы доставки и разработки конкретных терапевтических средств, подавляющих гены, которые по-прежнему являются безопасными и эффективными.
Arctic Apples - это набор яблок, зарегистрированных под торговой маркой, которые содержат признак отсутствия коричневого цвета, созданный с помощью сайленсинга генов для снижения экспрессии полифенолоксидазы (PPO). Это первый одобренный пищевой продукт, в котором используется этот метод.
