Войти
Микрофотография иммуноокрашенного среза GFAP опухоли головного мозга.In биохимия, иммуноокрашивание - это любое использование метода на основе антител для обнаружения специфического белка в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания срезов тканей, как впервые было описано Альбертом Кунсом в 1941 году. Однако в настоящее время иммуноокрашивание охватывает широкий спектр используемых методов. в гистологии, клеточной биологии и молекулярной биологии, в которых используются методы окрашивания на основе антител.
Иммуногистохимия или ИГХ окрашивание срезов ткани (или иммуноцитохимия, которая представляет собой окрашивание клеток ), возможно, является наиболее часто применяемым методом иммуноокрашивания. В то время как в первых случаях ИГХ-окрашивания использовались флуоресцентные красители (см. иммунофлуоресценция ), в других нефлуоресцентных методах использовались ферменты, например пероксидаза (см. окрашивание иммунопероксидазой ) и щелочная фосфатаза. Эти ферменты способны катализировать реакции, дающие окрашенный продукт, который легко обнаружить с помощью световой микроскопии. В качестве альтернативы, радиоактивные элементы можно использовать в качестве меток, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиографии.
Подготовка или фиксация ткани важны для сохранения морфологии клеток и тканей архитектура. Неправильная или продолжительная фиксация может значительно снизить способность связывания антител. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы в срезах тканей, залитых формалином -фиксированным парафином. Однако некоторые антигены не выдерживают даже умеренной фиксации альдегида. В этих условиях ткани следует быстро заморозить в жидком азоте и разрезать с помощью криостата. К недостаткам замороженных срезов можно отнести плохую морфологию, низкое разрешение при больших увеличениях, сложность разрезания парафиновых срезов и необходимость хранения в замороженном виде. В качестве альтернативы, срезы вибратома не требуют обработки ткани с помощью органических растворителей или высокой температуры, которая может разрушить антигенность, или разрушения путем замораживания-оттаивания. Недостатком вибратомных секций является то, что процесс секционирования медленный и трудный для мягких и плохо закрепленных тканей, и что на секциях часто видны следы вибрации или линии вибратома.
Выявление многих антигенов может быть значительно улучшено с помощью методов поиска антигена, которые действуют путем разрушения некоторых перекрестных связей белка, образованных при фиксации, для выявления скрытых антигенных сайтов. Это может быть достигнуто путем нагревания в течение разного времени (извлечение эпитопа, индуцированного нагреванием или HIER) или с использованием ферментного расщепления (извлечение эпитопа, индуцированного протеолитами или PIER).
Одной из основных трудностей с окрашиванием IHC является преодоление специфических или неспецифический фон. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация промывочных буферов и времени промывки после антител - все это важно для получения высококачественного иммуноокрашивания. Кроме того, наличие положительных и отрицательных контролей для окрашивания важно для определения специфичности.
A проточный цитометр может использоваться для прямого анализа клеток, экспрессирующих один или несколько конкретных белков. Клетки иммуноокрашивают в растворе с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для иммунофлуоресценции, а затем анализируют проточной цитометрией.
Проточная цитометрия имеет несколько преимуществ перед ИГХ, включая: способность определять отдельные популяции клеток по их размеру и гранулярности; способность удалять мертвые клетки; повышенная чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективной при обнаружении чрезвычайно редких популяций клеток, и при отсутствии среза ткани происходит потеря архитектурных отношений. Проточная цитометрия также требует высоких капитальных затрат, связанных с покупкой проточного цитометра.
Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать специфические белки из экстрактов, полученных из клеток или тканей, до или после любых этапов очистки. Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза перед переносом на синтетическую мембрану с помощью методов сухого, полусухого или влажного блоттинга. Затем мембрану можно исследовать с использованием антител, используя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Детекцию обычно проводят с использованием антител, связанных с пероксидазой, для катализа хемилюминесцентной реакции.
Вестерн-блоттинг - это обычный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка в экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет измерить молекулярную массу белка по сравнению с известными маркерами молекулярной массы.
Иммуноферментный анализ или ELISA - это диагностический метод для количественного или полуколичественного определения концентрации белка в плазме крови, сыворотка или экстракты клеток / тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В общем, белки в растворе адсорбируются на планшетах для ELISA. Антитела, специфичные для интересующего белка, используются для зондирования планшета. Фон сводится к минимуму за счет оптимизации методов блокирования и промывки (как для ИГХ), а специфичность обеспечивается за счет наличия положительных и отрицательных контролей. Методы обнаружения обычно основаны на колориметрии или хемилюминесценции.
Электронная микроскопия или ЭМ могут использоваться для изучения детальной микроархитектуры тканей или клеток. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золотом), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Несмотря на то, что иммуно-ЭМ эффективен в обнаружении субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогим и требовать строгой оптимизации методов фиксации и обработки ткани. Биотинилирование in vivo белка было предложено для облегчения проблем, вызванных частой несовместимостью окрашивания антител с протоколами фиксации, которые лучше сохраняют морфологию клеток.
В методах иммуноокрашивания, антитело используется для обнаружения специфического белка эпитопа. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Обнаружение этого первого или первичного антитела может осуществляться несколькими способами.
Как описано ранее, ферменты, такие как хреновый редис пероксидаза или щелочная фосфатаза, обычно используются для катализа реакций, дающих окрашенный или хемилюминесцентный продукт. Флуоресцентные молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной микроскопии.
Иммуноокрашивание имеет множество применений, но наиболее часто они используются в клинической диагностике и лабораторных исследованиях.
Клинически ИГХ используется в гистопатологии для диагностики конкретных типов рака на основе молекулярных маркеров.
В лабораторных исследованиях иммуноокрашивание может использоваться для множества применений, основанных на исследовании наличия или отсутствия белка, его тканевого распределения, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.
