Войти
Метилированная ДНК иммунопреципитация (MEDIP или mDIP) является крупномасштабной ( хромосома - или геном -широкого) метод очистки в области молекулярной биологии, которая используется для обогащения метилированных последовательностей ДНК. Он заключается в выделении метилированных фрагментов ДНК с помощью антител против 5-метилцитозина (5mC). Этот метод был впервые описан Weber M. et al. в 2005 году и помогла проложить путь к жизнеспособным усилиям по оценке на уровне метилома, поскольку очищенная фракция метилированной ДНК может быть использована для высокопроизводительных методов обнаружения ДНК, таких как микроматрицы ДНК высокого разрешения ( чип MeDIP ) или секвенирование следующего поколения. (MeDIP-seq). Тем не менее, понимание метилома остается рудиментарным; его изучение осложняется тем фактом, что, как и другие эпигенетические свойства, паттерны варьируются от клеточного типа к клеточному.
Метилирование ДНК, относящееся к обратимому метилированию 5-го положения цитозина метилтрансферазами, является основной эпигенетической модификацией в многоклеточных организмах. У млекопитающих эта модификация в первую очередь происходит на сайтах CpG, которые, в свою очередь, имеют тенденцию группироваться в регионах, называемых островками CpG. Существует небольшая часть CpG-островков, которые могут перекрываться или находиться в непосредственной близости от промоторных областей сайтов начала транскрипции. Модификация может также происходить в других сайтах, но метилирование в любом из этих сайтов может подавлять экспрессию гена, либо вмешиваясь в связывание факторов транскрипции, либо изменяя структуру хроматина до репрессивного состояния.
Исследования болезненных состояний во многом способствовали пониманию роли метилирования ДНК. В настоящее время основной исследовательский интерес заключается в изучении болезненных состояний, таких как рак, для выявления участков ДНК, которые претерпели обширные изменения метилирования. Гены, содержащиеся в этих областях, представляют функциональный интерес, поскольку они могут предложить механистическое объяснение основных генетических причин заболевания. Например, паттерн патологического метилирования раковых клеток первоначально был показан как механизм, посредством которого гены, подобные опухолевым супрессорам, заглушаются, хотя позже было обнаружено, что затрагивается гораздо более широкий диапазон типов генов.
Существует два подхода к анализу метилирования: технологии типирования и профилирования. Технологии типирования нацелены на небольшое количество локусов во многих образцах и включают использование таких методов, как ПЦР, рестрикционные ферменты и масс-спектрометрия. Технологии профилирования, такие как MeDIP, нацелены на оценку метилирования на уровне генома или метилома ; это включает в себя геномное сканирование рестрикционных ориентиров (RLGS) и методы, основанные на превращении бисульфита, которые основаны на обработке ДНК бисульфитом для преобразования неметилированных остатков цитозина в урацил.
Другие методы картирования и профилирования метилома оказались эффективными, но не лишены ограничений, которые могут влиять на разрешение, уровень пропускной способности или экспериментальные вариации. Например, RLGS ограничен количеством сайтов рестрикции в геноме, которые могут быть мишенями для рестрикционного фермента; обычно можно оценить максимум ~ 4100 ориентиров. Методы, основанные на бисульфитном секвенировании, несмотря на возможное разрешение одного нуклеотида, имеют недостаток: превращение неметилированного цитозина в урацил может быть нестабильным. Кроме того, когда преобразование бисульфита сочетается с ДНК-микрочипами для обнаружения сайтов превращения бисульфита, снижение сложности последовательности ДНК является проблемой. Микроматрицы, способные всесторонне профилировать весь геном, становится трудным в разработке, поскольку доступно меньше уникальных зондов.
В следующих разделах описывается метод MeDIP в сочетании с гибридизацией массивов с высоким разрешением или высокопроизводительным секвенированием. Каждый метод обнаружения ДНК будет также кратко описывать постлабораторную обработку и анализ. В зависимости от технологии, используемой для идентификации метилированных последовательностей, требуется различная постобработка исходных данных. Это аналогично данным, генерируемым с использованием ChIP-chip и ChIP-seq.
Обзор рабочего процесса процедуры MeDIP. За процедурой MeDIP следует матричная гибридизация (A) или высокопроизводительное секвенирование / секвенирование следующего поколения (B). Геномная ДНК извлекается ( выделение ДНК ) из клеток и очищается. Затем очищенную ДНК подвергают обработке ультразвуком, чтобы разделить ее на случайные фрагменты. Этот процесс обработки ультразвуком является быстрым, простым и позволяет избежать предвзятости ферментов рестрикции. Полученные фрагменты имеют длину от 300 до 1000 пар оснований (п.о.), хотя обычно они составляют от 400 до 600 п.н. Короткая длина этих фрагментов важна для получения адекватного разрешения, повышения эффективности последующего этапа иммунопреципитации и уменьшения влияния длины фрагмента или смещения. Кроме того, размер фрагмента влияет на связывание 5-метилцитидинового (5mC) антитела, потому что антителу требуется больше, чем просто 5mC для эффективного связывания. Для дальнейшего повышения аффинности связывания антител фрагменты ДНК денатурируют с образованием одноцепочечной ДНК. После денатурации ДНК инкубируют с моноклональными антителами 5mC. Затем применяется классический метод иммунопреципитации : магнитные шарики, конъюгированные с антителами против IgG мыши, используются для связывания антител против 5mC, а несвязанная ДНК удаляется в супернатанте. Для очистки ДНК добавляется протеиназа К, которая переваривает антитела и высвобождает ДНК, которую можно собрать и подготовить для обнаружения ДНК.
Для получения дополнительных сведений об экспериментальных этапах см.
Фракцию входной ДНК, полученной после стадии обработки ультразвука выше, метили цианин -5 (Cy5; красная) дезокси-цитозин-трифосфат в то время как метилированные ДНК, обогащенных после стадии иммунопреципитации, метят цианин -3 (Су3; зеленый). Меченые образцы ДНК совместно гибридизуют на 2-канальном геномном микрочипе высокой плотности для проверки присутствия и относительных количеств. Целью этого сравнения является идентификация последовательностей, которые показывают значительные различия в уровнях гибридизации, тем самым подтверждая, что интересующая последовательность обогащена. Идентификация последовательностей MeDIP на основе массива ограничена конструкцией массива. В результате разрешение ограничено датчиками в конструкции массива. При обработке сигналов требуются дополнительные стандартные шаги для исправления таких проблем гибридизации, как шум, как в случае с большинством технологий массивов.
Подробнее см.
Подход MeDIP-seq, то есть сочетание MeDIP с технологиями короткого считывания следующего поколения, такими как пиросеквенирование 454 или Illumina (Solexa), впервые был описан Down et al. в 2008 г. Высокопроизводительное секвенирование метилированных фрагментов ДНК дает большое количество коротких прочтений (36-50 п.н. или 400 п.н., в зависимости от технологии). Короткие чтения выравниваются по эталонному геному с помощью программного обеспечения для выравнивания, такого как Mapping and Assembly with Quality ( Maq ), которое использует байесовский подход, наряду с базовыми качествами и качествами отображения для моделирования вероятностей ошибок для выравниваний. Затем считывания могут быть расширены для представления фрагментов от ~ 400 до 700 п.н. из стадии обработки ультразвуком. Охват этих расширенных чтений можно использовать для оценки уровня метилирования региона. Генома браузер, такие как Ensembl также может быть использована для визуализации данных.
Подтверждение подхода к оценке качества и точности данных может быть выполнено с помощью количественной ПЦР. Это делается путем сравнения последовательности из образца MeDIP с неметилированной контрольной последовательностью. Затем образцы обрабатывают гелем и сравнивают интенсивности полос. Относительная интенсивность служит ориентиром для поиска обогащения. Результаты также можно сравнить с результатами чипа MeDIP, чтобы определить необходимое покрытие.
Простой рабочий процесс, демонстрирующий типичный эксперимент с использованием MeDIP-seq. Оценка уровня метилирования ДНК может быть затруднена из-за различной плотности метилированных сайтов CpG в геноме при наблюдении за данными, генерируемыми MeDIP. Это может быть проблематичным при анализе областей с низким содержанием CpG (с более низкой плотностью). Одной из причин этой проблемы с плотностью является ее влияние на эффективность иммунопреципитации. В своем исследовании Down et al. разработали инструмент для оценки абсолютных уровней метилирования на основе данных, полученных с помощью MeDIP, путем моделирования плотности метилированных сайтов CpG. Этот инструмент называется байесовским инструментом анализа метилирования (Бэтмен). В исследовании сообщается о покрытии ~ 90% всех сайтов CpG в промоторах, ген-кодирующих областях, островках и регуляторных элементах, где можно оценить уровни метилирования; это почти в 20 раз лучшее покрытие, чем любые предыдущие методы.
Исследования с использованием MeDIP-seq или MeDIP-chip являются общегеномными подходами, общая цель которых - получение функционального картирования метилома. После идентификации участков метилирования ДНК можно применить ряд биоинформатических анализов, чтобы ответить на определенные биологические вопросы. Один очевидный шаг - исследовать гены, содержащиеся в этих регионах, и исследовать функциональное значение их репрессии. Например, подавление генов-супрессоров опухолей при раке может быть связано с метилированием ДНК. Путем идентификации мутационных событий, ведущих к гиперметилированию и последующей репрессии известных генов-супрессоров опухолей, можно более конкретно охарактеризовать факторы, способствующие возникновению причины заболевания. Альтернативно, можно идентифицировать гены, которые, как известно, обычно метилированы, но в результате некоторого события мутации больше не заглушаются.
Кроме того, можно попытаться исследовать и определить, был ли затронут какой-либо эпигенетический регулятор, такой как ДНК-метилтрансфераза (DNMT); в этих случаях обогащение может быть более ограниченным.
Было показано, что анализ генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) сильно смещен при применении к данным метилирования с высокой пропускной способностью (например, MeDIP-seq и MeDIP-ChIP); Было высказано предположение, что это можно исправить, используя перестановки меток в образцах или используя статистическую модель для контроля различий в количестве зондов CpG / сайтов CpG, нацеленных на каждый ген.
Ограничения, которые следует учитывать при использовании MeDIP, являются типичными экспериментальными факторами. Это включает качество и перекрестную реактивность антител 5mC, используемых в процедуре. Кроме того, методы обнаружения ДНК (т.е. матричная гибридизация и высокопроизводительное секвенирование) обычно имеют четко установленные ограничения. В частности, для процедур на основе массивов, как упоминалось выше, анализируемые последовательности ограничиваются конкретным используемым дизайном массива.
Применяются наиболее типичные ограничения для высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. Проблема точности выравнивания повторяющихся областей в геноме приведет к менее точному анализу метилирования в этих областях. Кроме того, как упоминалось выше, короткие считывания (например, 36-50 пар оснований из анализатора генома Illumina ) представляют собой часть срезанного фрагмента при выравнивании по геному; следовательно, точный сайт метилирования может попадать в любое место в пределах окна, которое зависит от размера фрагмента. В этом отношении бисульфитное секвенирование имеет гораздо более высокое разрешение (вплоть до одного сайта CpG; уровень одного нуклеотида). Однако этот уровень разрешения может не требоваться для большинства приложений, поскольку было показано, что статус метилирования сайтов CpG в пределах lt;1000 п.н. значительно коррелирует.
