Протеиназа K

Протеиназа K
Структура протеиназы K.
Идентификаторы
Номер EC	3.4.21.64
Базы данных
IntEnz	IntEnz view
BRENDA	BRENDA entry
ExPASy	NiceZyme view
KEGG	KEGG entry
MetaCyc	метаболический путь
PRIAM	профиль
PDB структуры	RCSB PDB PDBe PDBsum
Search PMC статьи PubMed статьи NCBI белки

В молекулярной биологии Протеиназа K (EC 3.4.21.64, протеаза K, эндопептидаза K, щелочная протеиназа Tritirachium, сериновая протеиназа Tritirachium album, протеиназа Tritirachium album K) представляет собой сериновую протеазу широкого спектра действия. Фермент был обнаружен в 1974 году в экстрактах из альбома fungus Engyodontium (бывший альбом). Протеиназа К способна переваривать волосы (кератин ), отсюда и название «Протеиназа К». Преобладающим сайтом расщепления является пептидная связь, прилегающая к карбоксильной группе алифатической и ароматической аминокислот с заблокированной альфа аминогруппы. Он обычно используется из-за его широкой специфичности. Этот фермент принадлежит к семейству пептидаз S8 (субтилизин ). Молекулярная масса протеиназы К составляет 28 900 дальтон (28,9 кДа).

• 1 Активность фермента
• 2 Области применения
• 3 Ингибиторы
• 4 Ссылки
• 5 Внешние ссылки

Активированный кальцием, фермент переваривает белки предпочтительно после гидрофобных аминокислот (алифатических, ароматических и других гидрофобных аминокислот). Хотя ионы кальция не влияют на активность фермента, они вносят вклад в его стабильность. Белки будут полностью переварены, если время инкубации будет продолжительным и концентрация протеазы достаточно высока. После удаления ионов кальция стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность сохраняется. Протеиназа К имеет два сайта связывания для Са, которые расположены близко к активному центру, но не участвуют напрямую в каталитическом механизме. Остаточной активности достаточно для переваривания белков, которые обычно загрязняют препараты нуклеиновых кислот. Следовательно, расщепление протеиназой К для очистки нуклеиновых кислот обычно проводят в присутствии ЭДТА (ингибирование ферментов, зависимых от ионов металлов, таких как нуклеазы).

Протеиназа К также стабильна в широком диапазоне pH (4–12) с оптимумом pH 8,0. Повышение температуры реакции с 37 ° C до 50–60 ° C может увеличить активность в несколько раз, например при добавлении 0,5–1% додецилсульфата натрия (SDS) или хлорида гуанидиния (3 M), тиоцианат гуанидиния (1 M) и мочевина (4 M). Вышеупомянутые условия усиливают активность протеиназы К, делая сайты расщепления субстрата более доступными. При температуре выше 65 ° C трихлоруксусная кислота (TCA) или ингибиторы сериновой протеазы AEBSF, PMSF или DFP подавляют активность. Протеиназа K не ингибируется гуанидин хлоридом, тиоцианатом гуанидиния, мочевиной, саркозилом, тритоном X-100, Твин 20, SDS, цитрат, йодуксусная кислота, ЭДТА или другими ингибиторами сериновой протеазы, такими как Nα-тозил-Lys хлорметилкетон (TLCK) и Nα-тозил-Phe хлорметилкетон (TPCK).

Активность протеазы K в обычно используемых буферах

Протеиназа K обычно используется в молекулярной биологии для расщепления белка и удаления загрязнений с препаратов нуклеиновой кислоты. Добавление протеиназы К к препаратам нуклеиновых кислот быстро инактивирует нуклеазы, которые в противном случае могли бы разрушить ДНК или РНК во время очистки. Он очень подходит для этого применения, поскольку фермент активен в присутствии химических веществ, которые денатурируют белки, такие как SDS и мочевина, хелатирует агенты, такие как реагенты EDTA, сульфгидрил, а также ингибиторы трипсина или химотрипсина. Протеиназа К используется для разрушения белков в лизатах клеток (ткани, клетки культур клеток) и для высвобождения нуклеиновых кислот, так как она очень эффективно инактивирует ДНКазы и РНКазы. Некоторые примеры применения: Протеиназа К очень полезна для выделения высоконативных, неповрежденных ДНК или РНК, поскольку большинство ДНКаз и РНКаз микробов или млекопитающих быстро инактивируются ферментом, особенно в присутствии 0,5–1% SDS. Очистка геномной ДНК от бактерий (минипреп): бактерии из насыщенной жидкой культуры лизируются и белки удаляются путем гидролиза 100 мкг / мл протеиназы К в течение 1 ч при 37 ° C;

Активность фермента в отношении нативных белков стимулируется денатурантами, такими как SDS. Напротив, при измерении с использованием субстратов пептида денатуранты ингибируют фермент. Причина этого результата в том, что денатурирующие агенты разворачивают белковые субстраты и делают их более доступными для протеазы.

Протеиназа K имеет две дисульфидные связи, но проявляет более высокую протеолитическую активность в присутствие восстанавливающих агентов (например, 5 мМ DTT ), что позволяет предположить, что предполагаемое восстановление его собственных дисульфидных связей не приводит к его необратимой инактивации. Протеиназа K ингибируется ингибиторами сериновой протеазы, такими как фенилметилсульфонилфторид (PMSF ), диизопропилфторфосфат (DFP ) или 4- (2-аминоэтил) бензолсульфонилфторид (AEBSF ). На активность протеиназы K не влияют реагенты, модифицирующие сульфгидрил: пара-хлормеркурибензойная кислота (PCMB ), N-альфа-тозил-L-лизил-хлорметилкетон () или N-альфа-тозил-1- фенилаланин-хлорметилкетон (TPCK ), хотя предположительно, если бы эти реагенты были включены вместе с реагентами, восстанавливающими дисульфид, которые обнажали обычно недоступные тиолы протеиназы K, он мог бы затем ингибироваться.

.

• Протеиназа K Руководство по ферменту Уортингтона