Войти
Секвенирование красителей Illumina - это метод, используемый для определения серии пар оснований в ДНК, также известное как секвенирование ДНК. Концепция химии с обратимым терминированием была изобретена Бруно Канардом и Саймоном Сарфати в Институте Пастера в Париже. Он был разработан Шанкаром Баласубраманином и Дэвидом Кленерманом из Кембриджского университета, которые впоследствии основали Solexa, компанию, позже приобретенную Illumina. Этот метод секвенирования основан на обратимых терминаторах красителя, которые позволяют идентифицировать отдельные нуклеотиды, когда они промываются по цепям ДНК. Его также можно использовать для секвенирования всего генома и области, анализа транскриптома, метагеномики, обнаружения малых РНК, метилирования профилирование и анализ взаимодействия белок - нуклеиновая кислота по всему геному.
ДНК прикрепляется к проточной кювете посредством комплементарных последовательностей. Нить наклоняется и прикрепляется ко второму олиго, образуя мостик. Полимераза синтезирует обратную цепь. Две пряди отпустите и распрямите. Каждый образует новый мост (усиление моста). Результатом является кластер клонов прямой и обратной цепей ДНК. Технология секвенирования Illumina работает в трех основные шаги: усиление, последовательность и анализ. Процесс начинается с очищенной ДНК. ДНК фрагментируется, и добавляются адаптеры, содержащие сегменты, которые действуют как контрольные точки во время амплификации, секвенирования и анализа. Модифицированная ДНК загружается в проточную ячейку, где происходит амплификация и секвенирование. Проточная ячейка содержит нанокарманы, которые разделяют фрагменты и помогают справиться с переполненностью. Каждая нанолунка содержит олигонуклеотиды, которые обеспечивают точку прикрепления адаптеров. После присоединения фрагментов начинается фаза, называемая генерацией кластера. На этом этапе создается около тысячи копий каждого фрагмента ДНК и выполняется с помощью мостиковой ПЦР-амплификации. Затем на чип промывают праймеры и модифицированные нуклеотиды. Эти нуклеотиды имеют обратимый блокатор 3'-флуоресценции, поэтому ДНК-полимераза может добавлять только один нуклеотид за раз к фрагменту ДНК. После каждого цикла синтеза камера делает снимок чипа. Компьютер определяет, какая база была добавлена по длине волны флуоресцентной метки, и записывает ее для каждой точки на чипе. После каждого цикла невключенные молекулы смываются. Затем используется стадия химического деблокирования для удаления 3’-флуоресцентной концевой блокирующей группы. Процесс продолжается до тех пор, пока не будет секвенирована полная молекула ДНК. С помощью этой технологии тысячи мест по всему геному секвенируются одновременно с помощью массивного параллельного секвенирования.
После очистки ДНК библиотека ДНК, геномная библиотека, необходимо сгенерировать. Существует два способа создания геномной библиотеки: ультразвуковая обработка и тегирование. С помощью тегирования транспозаза случайным образом разрезает ДНК на фрагменты размером от 50 до 500 п.н. и одновременно добавляет адаптеры. Генетическая библиотека также может быть создана с использованием ультразвуковой обработки для фрагментации геномной ДНК. Ультразвуковая обработка фрагментирует ДНК до одинаковых размеров с помощью ультразвуковых звуковых волн. Правый и левый адаптеры должны быть присоединены ДНК-полимеразой Т7 и ДНК-лигазой Т4 после обработки ультразвуком. Нити, к которым не удалось лигировать адаптеры, смываются.
Двухцепочечная ДНК расщепляется транспосомами. Обрезанные концы восстанавливаются, и к каждой цепи ДНК добавляются адаптеры, индексы, сайты связывания праймеров и концевые сайты. Изображение частично основано на видео о секвенировании Illumina Адаптеры содержат три разных сегмента: последовательность, комплементарную твердой подложке (олигонуклеотиды на проточной кювете), последовательность штрих-кода (индексы) и сайт связывания для праймер для секвенирования. Индексы обычно состоят из шести пар оснований и используются при анализе последовательности ДНК для идентификации образцов. Индексы позволяют обрабатывать до 96 различных выборок вместе, это также известно как мультиплексирование. Во время анализа компьютер группирует все чтения с одним индексом вместе. Illumina использует подход «последовательность за синтезом». Этот процесс происходит внутри проточной стеклянной ячейки с акриламидным покрытием. Проточная ячейка имеет олигонуклеотиды (короткие нуклеотидные последовательности), покрывающие дно ячейки, и они служат твердой опорой для удержания цепей ДНК на месте во время секвенирования. Когда фрагментированная ДНК промывается через проточную ячейку, соответствующий адаптер прикрепляется к дополнительной твердой подложке.
Миллионы олигонуклеотидов выстилают нижнюю часть каждой полосы проточной кюветы. После присоединения можно начинать формирование кластера. Цель состоит в том, чтобы создать сотни идентичных цепочек ДНК. Некоторые будут передней прядью; в остальном наоборот. Вот почему используются правый и левый переходники. Кластеры генерируются посредством мостовой амплификации. ДНК-полимераза движется по цепи ДНК, создавая ее дополнительную цепь. Исходная прядь смывается, остается только обратная прядь. Вверху обратной нити находится переходная последовательность. Нить ДНК изгибается и прикрепляется к олиго, которое комплементарно верхней последовательности адаптера. Полимеразы прикрепляются к обратной нити, и создается ее дополнительная нить (которая идентична исходной). Теперь двухцепочечная ДНК денатурируется, так что каждая цепь может отдельно присоединяться к олигонуклеотидной последовательности, прикрепленной к проточной ячейке. Одна будет обратной прядью; другой, нападающий. Этот процесс называется мостовой амплификацией, и он происходит сразу для тысяч кластеров по всей проточной кювете.
Снова и снова нити ДНК изгибаются и прикрепляются к твердому телу. поддержка. ДНК-полимераза будет синтезировать новую цепь для создания двухцепочечного сегмента, который будет денатурирован, так что все цепи ДНК в одной области будут из одного источника (клональная амплификация). Клональная амплификация важна для контроля качества. Если обнаруживается, что нить имеет нечетную последовательность, ученые могут проверить обратную цепочку, чтобы убедиться, что в ней есть комплемент такой же странности. Прямые и обратные нити действуют как проверки для защиты от артефактов. Поскольку при секвенировании Illumina используется ДНК-полимераза, наблюдались ошибки замещения оснований, особенно на 3'-конце. Парные конечные чтения в сочетании с генерацией кластера могут подтвердить, что произошла ошибка. Обратная и прямая цепочки должны дополнять друг друга, все обратные чтения должны совпадать друг с другом, а все прямые чтения должны соответствовать друг другу. Если чтение недостаточно похоже на его копии (с которыми он должен быть клоном), возможно, произошла ошибка. В некоторых лабораторных анализах использовался минимальный порог сходства 97%.
В конце клональной амплификации все обратные цепи смываются с проточной ячейки, оставив только передние пряди. Праймер прикрепляется к сайту связывания праймера адаптера прямых цепей, и полимераза добавляет флуоресцентно меченый дНТФ к цепи ДНК. Только одно основание может быть добавлено за раунд из-за того, что флуорофор действует как блокирующая группа; однако группа блокировки обратима. Используя четырехцветную химию, каждая из четырех оснований имеет уникальное излучение, и после каждого раунда машина записывает, какая база была добавлена. После регистрации цвета флуорофор смывается, а другой dNTP промывается над проточной ячейкой, и процесс повторяется. dATP, dTTP, dGTP и dCTP промывают клетку отдельно, так что каждый нуклеотид может быть идентифицирован.
Начиная с запуска NextSeq, а затем MiniSeq, Illumina представила новую химию двухцветного секвенирования. Нуклеотиды различаются по одному из двух цветов (красный или зеленый), без цвета («черный») или по сочетанию обоих цветов (оранжевый цвет представляет собой смесь красного и зеленого).
Меченые нуклеотиды добавляются в цепь ДНК по порядку. Каждый из четырех нуклеотидов имеет идентифицирующую метку, которая может быть возбуждена для излучения характерной длины волны. Компьютер записывает все выбросы, и из этих данных производятся вызовы базы. После считывания цепи ДНК только что добавленная цепь смывается. Затем присоединяется праймер с индексом 1, полимеризуется последовательность с индексом 1 и смывается. Нить снова образует мостик, а 3'-конец цепи ДНК присоединяется к олиго на проточной ячейке. Праймер индекса 2 прикрепляется, полимеризует последовательность и смывается.
Полимераза устанавливает последовательность комплементарной цепи на вершине дугообразной цепи. Они разделяются, и 3 'конец каждой пряди блокируется. Прямая цепь смывается, и процесс последовательности путем синтеза повторяется для обратной цепи.
Секвенирование происходит сразу для миллионов кластеров, и каждый кластер имеет ~ 1000 идентичных копий вставки ДНК. Данные последовательности анализируются путем нахождения фрагментов с перекрывающимися областями, называемых контигами, и их выравнивания. Если эталонная последовательность известна, контиги затем сравниваются с ней для идентификации вариантов.
Этот поэтапный процесс позволяет ученым видеть полную последовательность, даже если нефрагментированная последовательность никогда не запускалась; однако, поскольку длины чтения Illumina не очень велики (секвенирование HiSeq может дать длину чтения около 90 п.н.), может возникнуть проблема с устранением участков коротких тандемных повторов. Кроме того, если последовательность является de novo и ссылки не существует, повторяющиеся области могут вызвать большие трудности при сборке последовательности. Дополнительные трудности включают замены оснований (особенно на 3'-конце считываний) неточными полимеразами, химерными последовательностями и смещением ПЦР, все из которых могут способствовать созданию неправильной последовательности.
Этот метод предлагает несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами секвенирования, такими как секвенирование по Сэнгеру. Секвенирование по Сэнгеру требует двух реакций, одну для прямого праймера, а другую для обратного праймера. В отличие от Illumina, при секвенировании по Сэнгеру используются флуоресцентно меченные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP) для определения последовательности фрагмента ДНК. В ddNTP отсутствует 3 'ОН-группа, что приводит к окончательному прекращению синтеза ДНК. В каждую реакционную пробирку добавляются dNTP и ddNTP, а также ДНК-полимераза и праймеры. Отношение ddNTP к dNTP имеет значение, поскольку матричная ДНК должна быть полностью синтезирована, а избыток ddNTP создает множество фрагментов того же размера и положения, что и матрица ДНК. Когда ДНК-полимераза добавляет ddNTP, фрагмент обрывается и синтезируется новый фрагмент. Каждый синтезированный фрагмент на один нуклеотид длиннее предыдущего. Как только матрица ДНК будет полностью синтезирована, фрагменты разделяют капиллярным электрофорезом. Внизу капиллярной трубки лазер возбуждает флуоресцентно меченые ддНТФ, и камера фиксирует излучаемый цвет.
Благодаря автоматическому характеру секвенирования красителей Illumina можно секвенировать сразу несколько нитей и быстро получить фактические данные секвенирования. При секвенировании по Сэнгеру единовременно можно секвенировать только одну цепь, и это относительно медленно. Illumina использует только ДНК-полимеразу в отличие от множества дорогостоящих ферментов, необходимых для других методов секвенирования (например, пиросеквенирование ).
Секвенирование Illumina имеет были использованы для исследования транскриптомов сладкого картофеля и рода голосеменных Taxus.
