Войти
Обзор некоторых биологических функций RdDM. Вверху слева: подавление TE by RdDM предотвращает активацию и транспозицию TE. Без RdDM активные ТЕ могут свободно переноситься в гены или промоторы, что может нарушить экспрессию генов или привести к появлению мутантного белка. Вверху справа: RdDM участвует в нескольких аспектах разработки; например, RdDM влияет на время цветения, подавляя FWA. В пыльце TE активируются в поддерживающей клетке, что приводит к продукции sRNAs для RdDM, которые перемещаются в зародышевую клетку, чтобы усилить молчание TE. Внизу слева: sRNAs, участвующие в RdDM, являются мобильными и могут перемещаться между клетками через плазмодесмы или системно через сосудистую сеть, так что RdDM-опосредованное молчание может распространяться от точки своего происхождения к дистальным тканям. Внизу справа: RdDM участвует в нескольких реакциях на абиотический стресс, включая реакцию теплового шока, и может заглушить ТЕ, которые в противном случае стали бы активными и переместились бы под действием теплового стресса. RdDM также участвует в защите от патогенов и может заглушить вирусную ДНК (либо в виде минихромосомы вируса, как показано, либо в виде интегрированного провируса) с использованием мРНК, полученных из вирусных мРНК. РНК-направленное метилирование ДНК (RdDM) - это биологический процесс, в котором молекулы некодирующей РНК управляют добавлением метилирования ДНК к конкретным последовательностям ДНК. Путь RdDM является уникальным для растений, хотя другие механизмы РНК-направленной модификации хроматина также описаны у грибов и животных. На сегодняшний день путь RdDM лучше всего охарактеризован в пределах покрытосеменных (цветковых растений), и особенно в пределах модельного растения Arabidopsis thaliana. Однако консервативные компоненты пути RdDM и связанные с ними малые РНК (мРНК) также были обнаружены в других группах растений, таких как голосеменные и папоротники. Путь RdDM очень похож на другие пути sRNA, особенно на высококонсервативный путь RNAi, обнаруженный у грибов, растений и животных. Пути RdDM и RNAi продуцируют мРНК и включают консервативные белки Argonaute, Dicer и РНК-зависимую РНК-полимеразу.
RdDM участвует в ряде регуляторных процессов у растений. Метилирование ДНК, добавляемое RdDM, обычно связано с репрессией транскрипции генетических последовательностей, на которые нацелен этот путь. Поскольку паттерны метилирования ДНК у растений наследуются, эти изменения часто могут стабильно передаваться потомству. В результате одной важной ролью RdDM является стабильное трансгенерационное подавление активности мобильного элемента (TE). RdDM также был связан с защитой от патогена, ответами на абиотический стресс и регуляцией нескольких ключевых переходов в развитии. Хотя путь RdDM выполняет ряд важных функций, мутанты с дефектом RdDM у Arabidopsis thaliana жизнеспособны и могут воспроизводиться, что позволило провести подробные генетические исследования этого пути. Однако мутанты RdDM могут иметь ряд дефектов у разных видов растений, включая летальность, измененные репродуктивные фенотипы, активацию TE и нестабильность генома, а также повышенную чувствительность к патогенам. В целом, RdDM является важным путем в растениях, который регулирует ряд процессов путем установления и усиления определенных паттернов метилирования ДНК, что может приводить к трансгенерационным эпигенетическим эффектам на экспрессию генов и фенотип.
RdDM участвует в ряде биологических процессов в растении, включая стрессовые реакции, межклеточную коммуникацию и поддержание стабильности генома посредством подавления TE.
ТЕ представляют собой фрагменты ДНК, которые при экспрессии могут перемещаться по геному с помощью механизма копирования и вставки или вырезания и вставки. Новые вставки TE могут нарушить кодирующие белки или регуляторные последовательности генов, что может повредить или убить клетку или организм-хозяин. В результате у большинства организмов есть механизмы предотвращения экспрессии ТЕ. Это особенно важно в геномах растений, которые часто богаты ТЕ. Некоторые виды растений, включая важные сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза и пшеница, имеют геномы, состоящие из более чем 80% ТЕ. RdDM играет ключевую роль в подавлении молчания этих мобильных элементов ДНК в растениях, добавляя метилирование ДНК по сравнению с новыми вставками ТЕ и постоянно усиливая метилирование ДНК по сравнению с существующими ТЕ, ингибируя транспозицию и поддерживая долгосрочную стабильность генома. Хотя сам механизм RdDM уникален для растений, использование метилирования ДНК для подавления TE является распространенной стратегией среди эукариот.
RdDM в первую очередь нацелен на небольшие TE и фрагменты TE рядом с генами, которые обычно находятся в открытом доступе эухроматические области генома, допускающие экспрессию генов. В этих регионах «активное» состояние хроматина имеет тенденцию распространяться от экспрессируемых генов к соседним репрессированным областям, таким как ТЕ, что может вызывать активацию и транспозицию этих ТЕ. Непрерывная активность RdDM препятствует распространению активного хроматина, поддерживая молчащее репрессивное гетерохроматическое состояние над TE в этих, в остальном, эухроматических областях. В свою очередь, активность RdDM задействует другие пути, которые помогают установить и распространять молчащее гетерохроматическое состояние (см. «Взаимодействие между RdDM и другими путями, модифицирующими хроматин»). Из-за самоусиливающейся природы этих путей сайленсинга чрезмерная активность RdDM может также вызывать молчащее, гетерохроматическое состояние хроматина над TE, чтобы распространяться на близлежащие гены и репрессировать их, с потенциально опасными последствиями для организма. Следовательно, активность RdDM должна быть точно настроена, чтобы поддерживать баланс между репрессией ТЕ и возможностью экспрессии близлежащих генов.
Помимо поддержания стабильного подавления ТЕ, RdDM может также инициировать подавление транскрипции чужеродной ДНК, включая новую ТЕ вставки, вирусные последовательности и трансгены (см. также «Биотические стрессы» и «Подавление трансгена» ниже). Когда TE интегрируются рядом с генами, RdDM-опосредованное подавление TE часто влияет на экспрессию генов. Однако это не всегда вредно и иногда может быть преодолено другими процессами или изменением экспрессии генов способами, полезными для растения. Со временем полезные ТЕ могут стать важной частью механизма, с помощью которого регулируется ген. В одном примере ген ROS1 расположен рядом с небольшим гелитроном TE, который обычно метилирован RdDM. Хотя метилирование ДНК обычно связано с репрессией транскрипции, это не относится к локусу ROS1. Вместо этого метилирование ТЕ гелитрона способствует экспрессии ROS1, поэтому экспрессия ROS1 теряется у мутантов пути RdDM, которые не могут метилировать ТЕ. Интересно, что ROS1 кодирует ДНК-гликозилазу, которая устраняет метилирование ДНК из генома. Связь между экспрессией ROS1 и активностью RdDM в этом TE гарантирует, что активности метилирования ДНК и деметилирования остаются в равновесии, помогая поддерживать гомеостаз метилирования ДНК во всем геноме. Таким образом, RdDM-опосредованная регуляция TE может привести к положительным регуляторным результатам.
Некоторые ТЕ развили механизмы для подавления или избегания основанного на RdDM молчания, чтобы облегчить их собственное размножение, что приводит к эволюционной гонке вооружений между ТЕ и их геномами хозяина. В одном примере было обнаружено, что последовательность, полученная из ТЕ, продуцирует мРНК, которые запускают посттранскрипционную репрессию компонента пути RdDM, ингибируя RdDM. Эта последовательность, возможно, помогла исходному TE избежать молчания на основе RdDM и встроиться в геном хозяина.
Изучение того, как RdDM нацеливается и подавляет различные типы TE, привело к большому пониманию того, как работает механизм RdDM. ретротранспозон EVADÉ (EVD) был одним из первых TE, специфически подавляемых мРНК, полученной из RdDM. Более поздние работы использовали EVD, чтобы проследить механизм, с помощью которого новая вставка TE заглушается, выявляя важную механистическую связь между посттранскрипционным заглушением гена и RdDM. Исследования других ретротранспозонов, включая ONSEN, который регулируется как RdDM, так и тепловым стрессом, и TE семейства Athila, среди многих других, также предоставили ценную информацию о RdDM-опосредованном подавлении TE.
Ряд эпигенетических изменений, необходимых для нормального развития и размножения цветковых растений, связан с RdDM. В хорошо изученном примере RdDM требуется для репрессии гена FWA, что обеспечивает правильное время цветения у Arabidopsis. Промотор FWA содержит тандемные повторы, которые обычно метилируются RdDM, что приводит к репрессии транскрипции. Потеря этого метилирования повторно активирует экспрессию FWA, вызывая фенотип позднего цветения. Потеря метилирования ДНК и связанный с этим фенотип позднего цветения могут стабильно передаваться потомству. Поскольку деметилированный аллель fwa приводит к стабильному наследуемому изменению экспрессии FWA без каких-либо изменений в последовательности ДНК, это классический пример эпиаллеля.
. Мутации в пути RdDM могут сильно повлиять на формирование гаметы и жизнеспособность семян, особенно у видов растений с высоким содержанием ТЕ, таких как кукуруза и Brassica rapa, что подчеркивает важность этого пути в воспроизводстве растений. Во время образования гамет было выдвинуто предположение, а в некоторых случаях показано, что RdDM помогает усиливать молчание TE в половых клетках. Как в пыльце, так и в семязачатках опорная клетка подвергается эпигенетическому репрограммированию, теряя метилирование ДНК и другие эпигенетические метки в ряде локусов, включая TE. Это вызывает повторную активацию TE и стимулирует продукцию мРНК, полученных из RdDM, против этих TE в поддерживающих клетках. Затем считается, что мРНК перемещаются из поддерживающей клетки в зародышевую клетку, чтобы усилить молчание TE в следующем поколении. Это явление наблюдалось в пыльце, но еще не было выявлено окончательно в семяпочке. Эта роль мРНК в растениях напоминает роль пиРНК в развитии зародышевой линии у Drosophila и некоторых других животных. Подобный феномен может также происходить в корнях, чтобы сохранить молчание TE в важных популяциях стволовых клеток.
Путь RdDM также участвует в регуляции импринтированной экспрессии некоторых генов. Этот необычный паттерн экспрессии, специфичный для родительского происхождения, встречается в нескольких локусах в эндосперме во время развития семян у цветковых растений. Некоторые факторы, участвующие в пути RdDM, сами импринтируются (способствуя экспрессии отцовского аллеля) у различных видов, включая A. thaliana, A. lyrata, C. краснуху и кукурузу. RdDM также играет роль в опосредовании эффектов дозировки гена, наблюдаемых в семенах, полученных от интерплоидных скрещиваний, хотя механизм этого остается в значительной степени неизвестным.
Также есть свидетельства того, что RdDM играет роль в нескольких других аспектах развития растений, включая покой семян, созревание плодов и другие пути, участвующие в цветении. Однако большинство этих данных коррелятивны, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять роль RdDM в этих процессах.
RdDM помогает растениям реагировать на ряд абиотических стрессов, таких как тепловой стресс, засуха, фосфатное голодание, солевой стресс и другие. Многие TE становятся активными в условиях абиотического стресса, и, таким образом, одна из функций RdDM в ответ на стресс - помочь противодействовать этой активации. В одном примере ретротранспозон ONSEN активируется тепловым стрессом, но в норме остается подавленным RdDM-ассоциированными мРНК и может эффективно транспонироваться только в подверженных тепловому стрессу растениях, которые также испытывают дефицит по RdDM. В более общем плане, у растений, подвергшихся тепловому стрессу, некоторые компоненты пути RdDM становятся активными, а мутации в некоторых компонентах механизма RdDM снижают устойчивость к теплу, предполагая, что RdDM играет важную роль во время теплового стресса. Помимо регуляции ТЕ в условиях стресса, RdDM может также регулировать гены, чтобы вызывать соответствующие стрессовые реакции. При низкой влажности на листьях образуется меньше устьиц из-за опосредованной RdDM подавления двух генов, участвующих в развитии устьиц. Точно так же RdDM становится подавленным в ответ на солевой стресс, и было показано, что это запускает экспрессию фактора транскрипции, важного для устойчивости к солевому стрессу.
RdDM изначально был обнаружен как ответ на заражение вироидами, и вместе с РНКи играет важную роль в защите растения от вироидов и вирусов. Механизм RdDM и RNAi распознает вирусные РНК и преобразует их в мРНК, которые затем могут использоваться как для разрушения вирусной РНК (RNAi), так и для подавления вирусной ДНК (RdDM). Однако мало что известно о том, как механизмы RdDM и RNAi различают вирусные РНК и РНК, продуцируемые растением-хозяином. Мутанты, дефектные по RdDM, и другие мутанты с дефицитом метилирования часто гиперчувствительны к вирусной инфекции. Взаимодействие вирус-хозяин - еще один пример эволюционной гонки вооружений, и многие вирусы растений кодируют супрессоры как RdDM, так и RNAi в попытке обойти защиту растения-хозяина.
RdDM также участвует в защите растения от других биотические стрессы, включая бактериальные инфекции, грибковые инфекции и хищничество. Потеря RdDM может оказывать противоположное влияние на устойчивость к различным патогенам. Например, некоторые мутанты RdDM обладают повышенной восприимчивостью к бактерии Agrobacterium tumefaciens, но те же самые мутанты имеют пониженную чувствительность к бактерии Pseudomonas syringae, что подчеркивает сложность различных путей защиты от патогенов и их взаимодействия с RdDM.
Помимо естественных стрессоров чужеродных нуклеиновых кислот, таких как TE и вирусы, также являются искусственно введенные последовательности ДНК, такие как трансгены нацелены на репрессии со стороны RdDM. Трансгены широко используются в генетических исследованиях для изучения функции и регуляции генов, а также в селекции растений для придания растению новых и желаемых свойств. Таким образом, подавление трансгена с помощью RdDM и других механизмов оказалось проблемой для исследователей растений. Попытки понять, как трансгены заглушаются, в конечном итоге помогли раскрыть многое из того, что мы теперь знаем о пути RdDM (см. «История и открытие RdDM»). В одном из ранних примеров исследователи последовательно трансформировали растения двумя разными трансгенами, у которых была общая последовательность ДНК. Они обнаружили, что преобразование второго трансгена в растения привело к тому, что первый трансген приобрел метилирование ДНК и стал инактивированным. Это дало ранний ключ к пониманию того, что существует транс-действующий, основанный на последовательности механизм подавления транскрипции чужеродной ДНК, которая, как позже было показано, является RdDM.
Из-за наследуемости паттернов метилирования ДНК у растений и самоусиливающейся природы RdDM и других путей метилирования ДНК любые изменения метилирования ДНК вызванные стрессовыми факторами окружающей среды, могут сохраняться и передаваться будущим поколениям. Это может позволить вызванным стрессом изменениям метилирования ДНК действовать как «память» о стрессоре и помочь растению или его потомству более эффективно реагировать на стресс при повторном воздействии. Например, полученные из RdDM мРНК против TE или вирусов, которые уже интегрировались в геном и были замалчены, служат «памятью» об этих предшествующих инфекциях, защищая от будущих вторжений аналогичными последовательностями. Есть также свидетельства того, что изменения метилирования ДНК из-за других факторов стресса, таких как солевой или тепловой стресс, могут сохраняться в потомстве растений, подвергшихся стрессу, даже в отсутствие исходного стрессора. В этом исследовании для устойчивости вызванных стрессом изменений метилирования ДНК требовалось несколько белков, связанных с RdDM, что позволяет предположить, что RdDM участвует в поддержании измененных стрессом паттернов метилирования ДНК. В другом примере устойчивость к атакам насекомых передавалась потомству через изменения метилирования ДНК, и это наследование также зависело от функциональных путей биогенеза мРНК. Таким образом, RdDM может потенциально изменять эпигеном растения в ответ на стресс и помогает поддерживать эти изменения, чтобы модулировать будущие реакции на стресс у пораженного растения и его потомков.
Молекулы мРНК, продуцируемые RdDM и другими путями, способны перемещаться между клетками через плазмодесмы, а также могут системно перемещаться через растение через сосудистую сеть. Следовательно, они могут действовать как сигнальные молекулы. Это было продемонстрировано на растениях, сконструированных для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP). Белок GFP, вырабатываемый этими растениями, заставлял их светиться зеленым при определенных условиях освещения. Когда ткань из второго растения, экспрессирующего конструкцию мРНК, комплементарную GFP, была трансплантирована на GFP-экспрессирующее растение, флуоресценция GFP пропадала: после пересадки мРНК, продуцируемые в тканях второго растения, перемещались в ткани первого, GFP-экспрессирующего растения, и запускающее молчание GFP. То же исследование показало, что подмножество этих мобильных мРНК запускало добавление метилирования ДНК в локус GFP через RdDM. Следовательно, sRNAs, участвующие в RdDM, могут действовать как сигнальные молекулы и запускать добавление метилирования ДНК в комплементарных локусах в клетках, далеко от того места, где sRNAs были первоначально созданы. С тех пор исследования показали, что мРНК могут перемещать и направлять RdDM как от побега к корню, так и от корня к побегу, хотя эффект сайленсинга более устойчив, когда мРНК перемещаются от побега к корню.
Движение мРНК, которые управляют RdDM. активность играет важную роль в развитии растений, в том числе во время размножения и развития корней. В обоих случаях движение sRNA, по-видимому, функционирует в первую очередь как способ усиления метилирования ДНК и заглушения TE в важных для развития типах клеток, таких как половые клетки и стволовые клетки. Молчание ТЕ и поддержание целостности генома в этих клетках особенно важно, поскольку они дают начало многим другим клеткам, все из которых наследуют любые дефекты или мутации в исходной стволовой клетке или зародышевой клетке. Движение мРНК также участвует во взаимодействиях между растениями и патогенами: мРНК могут перемещаться из инфицированных клеток в дистальные неинфицированные ткани, чтобы вызвать защитный ответ, хотя на сегодняшний день это было показано только для РНКи, а не для RdDM.
В этом разделе рассматриваются пути и механизмы, с помощью которых RdDM приводит к метилированию ДНК, специфичному для последовательности. Представленные здесь пути были охарактеризованы в первую очередь у модельного растения Arabidopsis thaliana, но, вероятно, аналогичны у других покрытосеменных. Сохранение RdDM у других видов растений более подробно обсуждается в разделе «Эволюционная консервация» ниже.
Контексты последовательностей метилирования ДНК и родственные метилтрансферазы ДНК. Метилирование ДНК в цитозинах с последующими гуанинами (метилирование CG) поддерживается MET1, тогда как метилирование CHG и CHH поддерживается CMT3 и CMT2, соответственно. Метилтрансфераза, участвующая в RdDM, DRM2, может добавлять метилирование ДНК независимо от контекста последовательности. RdDM - единственный механизм в растениях, который может добавлять метилирование ДНК к цитозинам независимо от контекста последовательности. Метилирование ДНК у растений обычно делится на три категории в зависимости от контекста последовательности метилированного цитозина: CG, CHG и CHH, где H - любой нуклеотид, кроме G. Они отражают различные контексты последовательностей, на которые нацелены несколько путей метилирования ДНК в растениях. Эти контекстно-зависимые пути в первую очередь участвуют в поддержании существующих паттернов метилирования ДНК. Высококонсервативная метилтрансфераза MET1 (гомолог DNMT1 млекопитающих) поддерживает метилирование ДНК в контексте CG, в то время как две консервативные специфичные для растений метилтрансферазы, Chromomethylase 3 (CMT3) и CMT2, помогают поддерживать метилирование CHG и CHH соответственно. В отличие от этих путей, RdDM приводит к добавлению метилирования ДНК по всем цитозинам независимо от контекста их последовательности. Подобно MET1, CMT2 и CMT3, RdDM в первую очередь участвует в поддержании существующих паттернов метилирования ДНК. Однако RdDM также является единственным путем, способным добавлять метилирование ДНК de novo к ранее неметилированным участкам растений.
Путь RdDM можно разделить на два основных процесса: производство мРНК и рекрутирование механизма метилирования ДНК этими мРНК в конкретные целевые локусы в ДНК. Эти две активности вместе составляют RdDM и в конечном итоге приводят к метилированию ДНК, добавляемому к цитозинам в определенных целевых локусах.
Схема канонического пути RdDM (вверху) и неканонических RdDM и RNAi / PTGS (внизу). Канонический путь RdDM может быть разбит на (1) продукцию мРНК и (2) направленное метилирование ДНК в сайты продукции мРНК. Неканонический путь RdDM тесно связан с RNAi и другими путями PTGS и отличается от канонического RdDM главным образом источником мРНК и процессингом мРНК. H3K9 = лизин 9 на гистоне H3; H3K4 = лизин 4 на гистоне H3; оцРНК = одноцепочечная РНК; dsRNA = двухцепочечная РНК, miRNA = microRNA Канонический путь RdDM, как следует из его названия, является наиболее хорошо охарактеризованным путем на сегодняшний день. Канонический RdDM преимущественно рекрутируется в области, которые уже являются ДНК-метилированными и гетерохроматическими, и действует, чтобы усилить существующие паттерны метилирования ДНК в этих локусах, образуя петлю положительной обратной связи. Канонический RdDM составляет большую часть активности RdDM в клетке.
Первая часть пути RdDM вращается вокруг биогенеза мРНК. Растительный комплекс РНК-полимеразы, РНК-полимераза IV (Pol IV), сначала рекрутируется в молчащий гетерохроматин через его взаимодействие с белками CLASSY (CLSY) и гомологом 1 гомеодомена SAWADEE (SHH1) (также см. между RdDM и другими путями модификации хроматина 'ниже). Pol IV транскрибирует эти области с образованием коротких одноцепочечных РНК (оцРНК) длиной примерно от 30 до 45 нуклеотидов, каждая из которых является предшественником одной мРНК. Эти оцРНК преобразуются в двухцепочечные РНК (дцРНК) котранскрипционно с помощью РНК-направленной РНК-полимеразы 2 (RDR2), которая физически связывается с Pol IV. Затем дцРНК расщепляются эндорибонуклеазой Dicer-like 3 (DCL3) на 24 нуклеотидные (нт) мРНК. Только Pol IV, RDR2 и DCL3 достаточны для продукции 24 н. МРНК in vitro, что позволяет предположить, что, хотя другие факторы, участвующие в этой части пути, могут способствовать повышению эффективности или специфичности, они не требуются для продукции мРНК, опосредованной Pol IV..
Хотя почти все 24 нРНК, участвующие в RdDM, продуцируются посредством пути Pol IV-RDR2-DCL3, небольшая часть продуцируется другими путями. Например, некоторые транскрипты РНК-полимеразы II (Pol II), содержащие инвертированную повторяющуюся последовательность, образуют двухцепочечные шпильчатые структуры, которые могут быть непосредственно расщеплены DCL3 с образованием 24 н. МРНК.
Во второй части пути механизм метилирования ДНК RdDM направляется последовательностям ДНК, комплементарным мРНК, генерируемым в первой части пути. Одна цепь из каждой двухцепочечной мРНК длиной 24 нуклеотида загружается в белки Argonaute (AGO) AGO4, AGO6 или AGO9. AGO3 также может действовать по этому пути. Аргонавты - это большое, высококонсервативное семейство белков, которые могут связывать мРНК, образуя дуплекс белок-мРНК, который позволяет им распознавать и связывать другие последовательности РНК, комплементарные их партнеру по мРНК. После образования дуплекс AGO-sRNA находит и связывает комплементарные последовательности вдоль «каркаса» РНК, продуцируемого растительной РНК-полимеразой V (Pol V), с помощью взаимодействий с супрессором Ty-вставки 5. -подобный (SPT5L), комплекс "Участвует в de novo 2" - IDN2 Paralog (IDN2-IDP) и субъединица Pol V NRPE1. Это приводит к привлечению фермента ДНК-метилтрансферазы, фермента, перегруппированного в доменах метилтрансферазы 2 (DRM2), которая метилирует близлежащую ДНК. Механизм, с помощью которого дуплекс AGO-sRNA рекрутирует DRM2, еще недостаточно изучен.
Недавние исследования выявили ряд вариаций пути RdDM, которые вместе называются неканонический RdDM. В отличие от канонического RdDM, неканонические пути обычно участвуют в установлении начального метилирования ДНК в новых целевых локусах, таких как новые вставки TE, а не в поддержании существующего гетерохроматина. Активно экспрессирующие элементы, такие как новые вставки TE, обычно сильно нацелены на посттранскрипционные пути подавления гена (PTGS / RNAi). Неканонический RdDM возникает в основном как побочный продукт этих путей PTGS, приводя к начальному установлению молчащего гетерохроматического состояния над новым TE или другим целевым локусом. Как только это начальное состояние молчания установлено, Pol IV может быть рекрутирован в локус с помощью CLSY и SHH1, и канонический путь RdDM берет на себя долгосрочное поддержание молчания. Следовательно, неканонические пути RdDM часто действуют как временный мост между начальным посттранскрипционным подавлением новых элементов с помощью RNAi и долгосрочным транскрипционным подавлением транскрипции через канонический RdDM. В соответствии с этой ролью в инициации нового сайленсинга, неканонический RdDM нацелен на относительно небольшое количество локусов по сравнению с каноническим RdDM.
Основное различие между каноническим и неканоническим путями RdDM заключается в происхождении и биогенезе вовлеченные мРНК. Канонический путь RdDM включает 24 н. МРНК, которые специфичны для этого пути и происходят преимущественно из одного источника (комплекс Pol IV-RDR2). Напротив, неканонические пути RdDM включают мРНК длиной 21-22 нуклеотида из множества источников, что позволяет инициировать метилирование ДНК de novo во многих различных типах локусов. Эти мРНК из 21–22 нуклеотидов не специфичны для неканонического RdDM, а также функционируют в других путях PTGS. Фактически, только небольшая часть 21-22nt мРНК участвует в RdDM, при этом большинство вместо этого управляет петлей положительной обратной связи, усиливая ответ PTGS. Функциональный результат конкретной мРНК длиной 21-22 нт зависит от белка AGO, с которым она в конечном итоге ассоциируется: мРНК, которые связываются с AGO4, AGO6 или AGO9, приводят к RdDM и метилированию ДНК, тогда как мРНК, которые связываются с другими AGO, такими как AGO1, в первую очередь приводят к in PTGS.
Используя 21–22 н. мРНК, происходящую из различных источников, неканонический RdDM может гибко индуцировать метилирование ДНК de novo и молчание во многих различных типах локусов. Одним из основных источников мРНК длиной 21–22 н. Являются транскрипты Pol II. Некоторые из этих транскриптов, особенно те, которые получены из TE, вирусов или определенных небелковых транскриптов, нацелены на пути PTGS, такие как miRNAs или RNAi, что приводит к расщеплению транскрипта. Полученные фрагменты могут быть преобразованы в дцРНК с помощью RDR6, а затем процессированы в мРНК длиной 21–22 нт с помощью DCL2 или DCL4. Большинство из этих 21-22 нуклеотидных мРНК загружаются в AGO1 и возвращаются в PTGS, усиливая эффективность PTGS. Однако некоторые вместо этого будут ассоциироваться с AGO6, что приведет к RdDM. dsRNAs, возникающие в результате активности RDR6, также могут иногда обрабатываться DCL3 вместо DCL2 / 4 и запускать RdDM. Кроме того, некоторые транскрипты Pol II содержат последовательности инвертированного повтора, которые могут образовывать двухцепочечные структуры, подобные шпилькам. Они могут расщепляться белками DCL независимо от RDR с образованием мРНК размером 21–22 н. Или 24 н., Которые могут участвовать в RdDM. Сходным образом предшественники miRNA, которые также образуют шпильчатые структуры и обычно расщепляются DCL1 с образованием miRNA, вместо этого могут расщепляться другими DCL с образованием sRNA для RdDM. Хотя большинство неканонических RdDM происходит через AGO6 или AGO4, существует также версия пути, в котором мРНК вместо этого связываются с AGO2, который вместе с комплексом NERD (необходим для RDR2-независимого метилирования ДНК) рекрутирует DRM2 в локусы-мишени и запускает ДНК. метилирование. Поскольку неканонические пути еще не так хорошо охарактеризованы, как канонический путь RdDM, вероятно, остаются дополнительные источники sRNAs, используемые для RdDM, которые еще не обнаружены.
Ряд факторов, участвующих в RdDM, перечислены ниже вместе с дополнительной информацией об их функциях и соответствующими ссылками. Также перечислены несколько факторов, в первую очередь участвующих в PTGS, которые иногда участвуют в RdDM.
| Фактор (ы) | Тип фактора | Путь | Роль в RdDM | Известные прямые взаимодействия | Описание | Ссылки |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NRPD1 и комплекс Pol IV | РНК-полимераза | Каноническая RdDM | продуцирование мРНК | Белки CLSY, RDR2 | Pol IV представляют собой комплекс РНК-полимеразы, специфичный для растений, и NRPD1, его самая большая субъединица, специфична для этого комплекса. Благодаря взаимодействию с белками CLSY и SHH1 Pol IV рекрутируется в гетерохроматиновые области (в частности, в H3K9me2 - и H3K4me0-содержащий хроматин) и транскрибирует одноцепочечные РНК-предшественники мРНК, используемых в каноническом RdDM. путь. | |
| NRPE1 и комплекс Pol V | РНК-полимераза | Все метилирование ДНК RdDM | целевых локусов | Pol V представляет собой комплекс РНК-полимеразы, специфичный для растений, и NRPE1, его самая большая субъединица, специфична для этого комплекса. Pol V транскрибирует некодирующие РНК, которые служат каркасом для нескольких других компонентов RdDM, в первую очередь дуплекса AGO-sRNA, но также SPT5L и комплекса IDN2-IDP. И NRPE1, и SPT5L содержат мотив крючка AGO, который помогает рекрутировать AGO4 в транскрипты Pol V. Мутация крючковых мотивов AGO на обоих белках приводит к снижению метилирования ДНК в целевых локусах RdDM, напоминая фенотипы нуль-мутантов nrpe1. Связывание дуплекса AGO-sRNA с комплементарными сайтами вдоль транскрипта Pol V приводит к привлечению DRM2 и добавлению метилирования ДНК в локусы-мишени. | ||
| RDR2 | РНК-зависимая РНК-полимераза | Canonical RdDM | продуцирование мРНК | Pol IV | Существует в комплексе с Pol IV и преобразует зарождающийся транскрипт Pol IV в двухцепочечную РНК, которая затем может быть обработана DCL3 для генерации мРНК для канонического RdDM. | |
| RDR6 | РНК-зависимая РНК-полимераза | PTGS, неканоническая RdDM | выработка мРНК | Конвертирует одноцепочечные РНК в двухцепочечные РНК для обработки в мРНК длиной 21-22 нуклеотида с помощью DCL2 и DCL4. Большинство этих мРНК приводят к PTGS, но некоторые загружаются в AGO6 и участвуют в неканоническом RdDM. | ||
| DCL1 | Эндорибонуклеаза | PTGS, неканоническая RdDM | продукция miRNA, продукция sRNA | Эндорибонуклеаза, расщепляющая двухцепочечную РНК, в первую очередь участвующая в производство микроРНК, которые приводят к PTGS через AGO1. Может также катализировать продукцию мРНК 21 нт из мРНК, содержащих инвертированные повторы, которые могут использоваться либо в PTGS, либо в неканоническом RdDM, в зависимости от белка AGO, с которым они связаны. Четыре белка DCL в A. thaliana (DCL1,2,3,4) конкурируют за доступ к субстратам дцРНК. | ||
| DCL2 | Эндорибонуклеаза | PTGS, неканонический RdDM | продуцирование мРНК | Эндорибонуклеаза, которая расщепляет двухцепочечную РНК, в результате чего получают мРНК из 22 нуклеотидов, которые могут может использоваться как в PTGS, так и в неканоническом RdDM. Четыре белка DCL в A. thaliana (DCL1,2,3,4) конкурируют за доступ к субстратам дцРНК, а DCL2,4 может замещать потерю DCL3 для большинства мишеней RdDM. | ||
| DCL3 | Эндорибонуклеаза | Каноническая RdDM | продуцирование мРНК | Эндорибонуклеаза, которая расщепляет двухцепочечную РНК, в результате чего мРНК из 24 нуклеотидов используются при каноническом RdDM. Предпочтительно нацелены на короткие дцРНК, продуцируемые Pol IV-RDR2, но могут также разрезать другие субстраты дцРНК, включая мРНК, содержащие инвертированные повторы или предшественники миРНК. Четыре белка DCL в A. thaliana (DCL1,2,3,4) конкурируют за доступ к субстратам дцРНК, а DCL2,4 может замещать потерю DCL3 для большинства мишеней RdDM. Когда пути PTGS через DCL2,4 становятся насыщенными, DCL3 может вмешиваться и обрабатывать субстраты дцРНК DCL2,4, запуская переключение с PTGS на TGS, опосредованный RdDM. | ||
| DCL4 | Эндорибонуклеаза | PTGS, неканонический RdDM | продуцирование мРНК | Эндорибонуклеаза, которая расщепляет двухцепочечную РНК, в результате чего мРНК размером 21 нт. использоваться как для PTGS, так и для неканонического RdDM. Четыре белка DCL в A. thaliana (DCL1,2,3,4) конкурируют за доступ к субстратам дцРНК, а DCL2,4 может замещать потерю DCL3 для большинства мишеней RdDM. | ||
| AGO4 | белок Argonaute | Канонический RdDM | метилирование ДНК целевых локусов | NRPE1, SPT5L | Основной белок Argonaute участвует в каноническом RdDM. AGO4 частично дублируется с AGO6, который также может функционировать в этом пути, а также с AGO9 в репродуктивных тканях. Он связывает мРНК длиной 24 нт, продуцируемые этим путем, с образованием дуплекса AGO4-мРНК, который может распознавать последовательности, комплементарные мРНК. Благодаря взаимодействию с SPT5L, NRPE1 и комплексом IDN2-IDP дуплекс AGO4-sRNA связывает одноцепочечную некодирующую РНК, продуцируемую Pol V, и помогает рекрутировать DRM2 в ДНК. | |
| AGO6 | Белок аргонавта | Все метилирование ДНК RdDM | целевых локусов | Белок аргонавта, который может функционировать как в канонических, так и в неканонических путях RdDM. Частично избыточен с AGO4 (основной канонический RdDM AGO). Может связываться с мРНК длиной 24 или 21–22 нуклеотидов, чтобы запустить RdDM в комплементарных локусах. Взаимодействуя как с мРНК из 21–22 нуклеотидов, так и с 24 нуклеотидами, AGO6 помогает в переходе от PTGS (обычно опосредованного мРНК из 21–22 нуклеотидов) к стабильному подавлению сигнала с помощью RdDM (обычно опосредованному мРНК из 24 нуклеотидов). Выражено особенно в меристемы корней и побегов, которые являются двумя основными популяциями стволовых клеток растений. Это может указывать на то, что растения усиливают наблюдение за новыми TE, чтобы гарантировать целостность генома в ключевых клетках, которые дадут начало большинству других клеток в растении. | ||
| AGO9 | Белок аргонавта | Канонический RdDM | метилирование ДНК целевых локусов | Узкоспециализированный AGO, экспрессирующийся преимущественно в зародышевой линии, где он необходим для правильного формирование женской гаметы. Взаимодействует с 24-нуклеотидной мРНК, чтобы заглушить TE в зародышевой линии, аналогично роли белков PIWI Argonaute у животных. | ||
| AGO1 | Белок аргонавта | PTGS, неканонический RdDM | продуцирование мРНК | Связывает микроРНК или 21-22 н. МРНК, которые он использует для распознавания комплементарных последовательности на других РНК. Когда дуплекс AGO1-sRNA (часто называемый RISC ) обнаруживает комплементарную одноцепочечную мРНК, РНК расщепляется AGO1, разрушая мРНК и вызывая PTGS. Полученные в результате фрагменты РНК затем могут быть преобразованы в дцРНК с помощью RDR6 и обработаны с помощью DCL2,4 с образованием вторичных мРНК длиной 21-22 нуклеотида. Они преимущественно загружаются обратно в AGO1, образуя самоусиливающуюся «петлю РНКи». Однако вместо этого некоторые из 21–22 нуклеотидных мРНК загружаются в AGO6, что приводит к RdDM. | ||
| DRM2 | ДНК-метилтрансфераза | Все RdDM | метилирование ДНК целевых локусов | Основная ДНК-метилтрансфераза, участвующая в RdDM. Катализирует присоединение метильной группы к цитозинам в ДНК. Рекрутируется дуплексом AGO4-мРНК после того, как он связывается с комплементарной последовательностью в транскрипте Pol V, но механизм, с помощью которого это происходит, не совсем понятен. | ||
| SHH1 / DTF1 | ДНК и белок, связывающий хроматин | Каноническая | продуцирование мРНК | CLSY1 | Требуется для Pol IV- производная мРНК в подмножестве локусов RdDM. Через свой домен SAWADEE SHH1 связывает гистон H3 со специфическими модификациями, связанными с гетерохроматином и метилированием ДНК: метилированием 9-го лизина (H3K9me2) и неметилированного K4 (H3K4me0). Взаимодействуя с SHH1 через белки CLSY, Pol IV рекрутируется на гетерохроматический / молчащий хроматин. На сегодняшний день показано, что SHH1 напрямую взаимодействует только с CLSY1. Способность SHH1 связываться с Pol IV / NRPD1 в основном отсутствует у двойных мутантов clsy1,2, поэтому рекрутирование Pol IV с помощью SHH1, вероятно, требует белков CLSY. | |
| CLSY1, CLSY2 | предполагаемые ремоделеры хроматина | Каноническая | продукция sRNA | Pol IV, SHH1 | Требуется для взаимодействия SHH1 с привлечением Pol IV к подмножеству целевых локусов. Взаимоисключающие с локусами, регулируемыми CLSY3 и CLSY4. Вместе четыре белка CLSY регулируют почти все производные Pol IV мРНК, и потеря всех четырех приводит к почти полной потере продукции 24-нуклеотидной мРНК. Требуется H3K9me2, вероятно, через взаимодействие с SHH1. мРНК, регулируемые с помощью CLSY1,2, обогащены в плечах хромосом, а мРНК, регулируемые с помощью CLSY3,4, обогащены в перицентромере. | |
| CLSY3, CLSY4 | предполагаемые ремоделеры хроматина | Каноническая | продукция мРНК, нацеливание на Pol IV | Pol IV | Участвует в рекрутирование Pol IV в подмножество целевых локусов. Взаимоисключающие с локусами, регулируемыми CLSY1 и CLSY2. Вместе четыре белка CLSY регулируют почти все Pol IV-sRNA, и потеря всех четырех приводит к почти полной потере продукции 24-нуклеотидной sRNA. мРНК, регулируемые CLSY3,4, обогащены перицентромерой, тогда как мРНК, регулируемые CLSY1,2, обогащены в плечах хромосом. | |
| HEN1 | РНК-метилаза | Обе | продукция мРНК | нет | Стабилизирует мРНК путем добавления метилирования к 3'- ОН группы. | |
| SUVH2, SUVH9 | метил-ДНК-связывающие белки | Оба | метилирование ДНК целевых локусов | комплекс DDR, MORC1, MORC6 | Пара тесно связанных белков, связывающих метил-ДНК, которые взаимодействуют с комплексом DDR и необходимы для правильной локализации комплекса DDR и Pol V. За счет привлечения Pol V к участкам с метилированием ДНК, которые имеют тенденцию быть молчащими, гетерохроматическими области, SU (VAR) 3-9 гомолог (SUVH) 2 и 9 помогают формировать петлю положительной обратной связи, которая усиливает опосредованное RdDM молчание. Может также ассоциироваться с MORC. | |
| Комплекс DDR (RDM1, DMS3, DRD1) | предполагаемый комплекс ремоделирования хроматина | Оба | метилирование ДНК целевых локусов | SUVH2, SUVH9 | Комплекс DDR, состоящий из DRD1, DMS3 и RDM1, как полагают, облегчает доступ Pol V к его сайтам-мишеням, возможно, за счет раскручивания ДНК ниже Pol V. Взаимодействует с SUVH2,9, которые связывают метилированную ДНК., и это взаимодействие может помочь рекрутировать Pol V в регионы существующего гетерохроматина. RDM1 также связывает одноцепочечную ДНК, которая может помочь раскрутить ДНК, чтобы облегчить рекрутирование DRM2. | |
| SPT5L / RDM3 / KTF1 | фактор транскрипции | Оба | метилирование ДНК целевых локусов | AGO4, транскрипты Pol V | Взаимодействует с AGO4 и помогает рекрутировать его в каркас РНК, продуцируемый Pol V. Подобно субъединице Pol V NRPE1, SPT5L содержит мотив крючка AGO в своем C-концевом домене. Мотивы как на NRPE1, так и на SPT5L избыточно помогают рекрутировать AGO4 в локусы, транскрибируемые Pol V. Мутация крючковых мотивов AGO на обоих белках приводит к снижению метилирования ДНК в локусах-мишенях RdDM, напоминая фенотипы нуль-мутантов nrpe1. Также требуется для ко-транскрипционного среза транскриптов Pol V. | |
| SWI / SNF комплекс | комплекс ремоделирования хроматина | Оба | метилирование ДНК целевых локусов | IDN2 | The Switch / Неферментируемый сахарозой (SWI / SNF) комплекс представляет собой комплекс ремоделирования хроматина, который рекрутируется на каркасы Pol V комплексом IDN2-IDP, где он влияет на позиционирование нуклеосом. SWI / SNF может способствовать RdDM, делая хроматин более доступным, что может облегчить доступ DRM2 к ДНК. | |
| Комплекс IDN2-IDP | дцРНК-связывающий белок | Оба | метилирование ДНК целевых локусов | Комплекс SWI / SNF | Комплекс, состоящий из IDN2 и IDP1 (также называемых IDNL1) или IDP2 (IDNL2). IDN2 и, возможно, IDP1 могут связываться с дуплексом дцРНК, образованным при гибридизации связанных с AGO мРНК с каркасом Pol V. Считается, что этот комплекс помогает стабилизировать спаривание оснований между AGO-sRNA и каркасной РНК Pol V. IDN2-IDP может также способствовать рекрутированию комплекса SWI / SNF на каркасы Pol V. Кроме того, IDP1 может связывать неметилированную ДНК, что может помочь рекрутировать DRM2 в области, в которых отсутствует метилирование ДНК. | |
| NERD | белок, содержащий повтор GW и PHD | Неканонический RdDM | Производство мРНК, метилирование ДНК целевых локусов | AGO2 | Образует неканонический путь RdDM, который включает ряд генов, участвующих в PTGS, включая AGO2. Связывает гистон H3 и AGO2. Требуется для накопления 21 нт мРНК на некоторых неканонических мишенях RdDM, включая новые вставки TE. Приводит к модификациям гистонового хвоста, связанным с репрессией транскрипции; поскольку эти модификации могут задействовать другие механизмы метилирования ДНК, включая канонический RdDM, неясно, является ли эффект NERD на метилирование ДНК прямым или косвенным. | |
| MORC1, MORC6 | АТФазы GHKL | Оба | метилирование ДНК целевых локусов (?) | SUVH2, SUVH9, IDN2, DMS3 | Microrchidia 1 (MORC1) и MORC6 образуют гетеродимер и могут взаимодействовать с комплексом DDR, рекрутируя Pol V. Однако считается, что они в основном действуют ниже метилирования ДНК, способствуя сайленсингу. Их точная роль в RdDM до сих пор неясна. | |
| DRM1 | ДНК-метилтрансфераза | Все RdDM | метилирование ДНК целевых локусов | Гомолог DRM2, который экспрессируется только во время полового размножения, особенно в яйце клетка и, возможно, ранний эмбрион. DRM2, вероятно, является основной метилтрансферазой RdDM во всех других тканях. | ||
| HDA6 | гистондеацетилаза | Каноническая RdDM | продукция мРНК | Может способствовать привлечению Pol IV за счет создания разрешающего состояния хроматина для связывания SHH1 путем удаления ацетилирования гистонов, способствуя метилированию H3K9. В мутантных растениях гистондеацетилазы 6 (hda6) локусы-мишени HDA6 теряют нацеливание на Pol IV и биогенез мРНК, что позволяет предположить, что HDA6 участвует в рекрутинге Pol IV в подмножестве локусов-мишеней RdDM. Кроме того, нормальное нацеливание Pol IV не может быть восстановлено после повторного введения функционального HDA6, предполагая, что HDA6 также необходим для распространения межпоколенческой «памяти» о том, куда должен быть нацелен Pol IV. HDA6 физически связывается с MET1 и способствует поддержанию метилирования CG с помощью MET1, что также может быть важно для продукции sRNA в HDA6-зависимых локусах. |
Различные состояния хроматина, такие как активный эухроматин или молчащий гетерохроматин, определяются комбинацией специфической модификации гистона и паттернов метилирования ДНК. Репрессивные модификации хроматина, такие как метилирование ДНК, способствуют уплотнению ДНК и уменьшают доступность ДНК, в то время как другие модификации помогают открывать хроматин и повышать доступность. Метилирование 9-го лизина гистона H3 (H3K9), прежде всего в форме триметилирования H3K9 (H3K9me3 ) у животных и диметилирования H3K9 (H3K9me2 ) у растений, является высококонсервативным репрессивным модификация. Отсутствие метилирования H3K4 (H3K4me0) также связано с репрессией, наряду с несколькими другими модификациями гистонов и вариантами. Комбинация метилирования ДНК, H3K9me2 и H3K4me0 прочно связана с гетерохроматином у растений.
Поскольку метилирование ДНК и репрессивные модификации гистонов вместе определяют гетерохроматин, большинство путей метилирования ДНК у растений распознают и взаимодействуют с репрессивными метками гистонов и наоборот, образуя петли положительной обратной связи, которые помогают поддерживать репрессивное состояние хроматина. Связанный с RdDM белок SHH1 распознает H3K4me0 и H3K9me2 в гетерохроматических локусах и рекрутирует Pol IV в эти локусы, чтобы запускать дополнительное метилирование ДНК в этих областях. Сходным образом SUVH2 и SUVH9 помогают рекрутировать Pol V в локусы с метилированием ДНК. Т.о., обе основные части канонического пути RdDM преимущественно рекрутируются в области, которые уже находятся в молчащем, гетерохроматическом состоянии, отмеченном метилированием ДНК, H3K9me2 и H3K4me0. Метилирование ДНК в этих же гетерохроматических локусах также распознается гистоновыми метилтрансферазами SUVH4 / KYP, SUVH5 и SUVH6, которые связываются с метилированием не-CG и добавляют H3K9me2 к соседним гистонам, замыкая петлю положительной обратной связи. Сходным образом CMT3 и CMT2, две ДНК-метилтрансферазы, участвующие в поддержании метилирования CHG и CHH соответственно, обе связывают и добавляют метилирование ДНК к H3K9me2-меченному гетерохроматину, образуя свою собственную петлю обратной связи с SUVH4 / 5/6. Эти взаимодействия помогают сильно усиливать молчание в TE и др. Гетерохроматиновых регионах.
Подобная петля обратной связи встречается у животных. HP1 играет жизненно важную роль в поддержании гетерохроматина путем распространения метилирования H3K9 через петлю положительной обратной связи с метилтрансферазой H3K9 SUV39H. Метилирование H3K9 задействует HP1, который задействует SUV39H для депонирования большего количества метилирования H3K9. Хотя HP1 сохраняется у растений, его функция в этой петле обратной связи нет. Напротив, петли положительной обратной связи между H3K9me2 и путями метилирования ДНК RdDM и CMT2 / 3 выполняют сходную функцию в распространении H3K9me2. Совсем недавно был идентифицирован специфичный для растений белок, Agenet Domain Contains Protein 1 (ADCP1), который может действовать аналогично HP1 в поддержании уровней H3K9me2 в гетерохроматине, способствуя образованию гетерохроматина.
В конечном итоге, постоянное усиление подавление модификаций хроматина в гетерохроматических локусах создает репрессивное состояние хроматина, при котором ДНК и гистоны (нуклеосомы ) становятся плотно упакованными вместе. Это помогает подавить экспрессию генов, физически подавляя доступ к ДНК, предотвращая инициирование транскрипции РНК-полимеразой II, факторами транскрипции и другими белками. Однако это же уплотнение также предотвращает доступ к ДНК факторов, участвующих в поддержании гетерохроматина, что может привести к потере молчащего компактного состояния. Это особенно верно в отношении плотного конститутивного гетерохроматина, окружающего центромеру. В этих регионах ремоделирующий хроматин DDM1 играет решающую роль в поддержании метилирования ДНК путем временного смещения нуклеосом, чтобы позволить метилтрансферазам и другим факторам получить доступ к ДНК. Однако, поскольку большинство мишеней для RdDM являются небольшими TE в открытых, доступных и богатых генами областях (см. «Замалчивание TE и стабильность генома»), немногим сайтам RdDM требуется DDM1. Фактически, плотный гетерохроматин подавляет RdDM. Напротив, CMT2 и CMT3 преимущественно функционируют в конститутивном гетерохроматине и сильно зависят от DDM1 для поддержания сайленсинга в этих областях. Сходным образом, MET1, который поддерживает метилирование ДНК в сайтах CG после репликации, требует, чтобы DDM1 имел доступ к гетерохроматину и поддерживал метилирование CG в этих областях. Таким образом, DDM1 является ключевым регулятором метилирования ДНК в плотном гетерохроматине, но регулирует сайты в основном независимо от RdDM.
Взаимодействия между RdDM и другими тремя путями поддерживающего метилирования ДНК ограничены и преимущественно косвенные. ДНК-метилтрансфераза MET1 надежно поддерживает метилирование CG по всему геному, в том числе по сайтам-мишеням RdDM. У мутантов RdDM не-CG-метилирование в сайтах-мишенях RdDM теряется, но CG-метилирование все еще сохраняется, указывая тем самым, что активность MET1 не зависит от RdDM. Однако, хотя мутанты met1 теряют метилирование CG, как и ожидалось, они также теряют большую часть своего метилирования не-CG, в том числе по целевым локусам RdDM. На этих сайтах молчание все еще может быть инициировано RdDM у мутантов met1, но оно не поддерживается и не передается потомству, что указывает на то, что MET1 важен для поддержания, но не для инициации сайленсинга в субнаборе целевых локусов RdDM. Этот эффект, вероятно, является косвенным: потеря MET1 приводит к потере H3K9me2 на некоторых сайтах, что ингибирует рекрутирование Pol IV и, следовательно, предотвращает поддержание метилирования ДНК посредством канонического RdDM, хотя неканонические пути (которые не включают Pol IV) не затронуты. Утрата гистондеацетилазы HDA6, которая облегчает поддерживающее метилирование с помощью MET1 в некоторых локусах, имеет сходный эффект, предполагая, что множество различных факторов, участвующих в поддержании гетерохроматина, вероятно, способствуют поддержанию опосредованного RdDM метилирования ДНК.
Утрата RdDM приводит к сильной потере метилирования не-CG в TE в богатых генами областях в плечах хромосом, но оказывает незначительное влияние на уровни метилирования ДНК в конститутивном гетерохроматине вокруг центромеры. Это указывает на то, что CMT2 и CMT3, которые функционируют в первую очередь для поддержания метилирования CHG и CHH в плотном конститутивном гетерохроматине, не зависят от активности RdDM. Сходным образом у двойных мутантов cmt2, cmt3 многие TE в плечах хромосом остаются метилированными, предположительно из-за постоянной активности RdDM, указывая тем самым, что потеря CMT2 / 3 мало влияет на активность RdDM. Это предполагает, что RdDM и CMT2 / 3 функционируют в основном независимо и в разных локусах: RdDM является основным путем, ответственным за поддержание не-CG-метилирования ДНК в эухроматических, богатых генами областях, тогда как CMT2 и CMT3 поддерживают метилирование не-CG ДНК в конститутивном гетерохроматине. У мутантов, дефектных как по RdDM, так и по CMT2 / CMT3, все метилирование не-CG в геноме устраняется, демонстрируя, что вместе RdDM и CMT2 / CMT3 составляют все не-CG-метилирование в геноме.
Большинство механизмов метилирования ДНК у растений являются самоусиливающимися (см. Выше), включая RdDM: Pol IV и Pol V задействуются в гетерохроматических областях, которые уже имеют Метилирование ДНК, стимулирующее дополнительное метилирование ДНК посредством канонического RdDM. Подобные петли положительной обратной связи могут вызывать распространение активности метилирования ДНК с намеченных метилированных сайтов-мишеней на гены или другие регуляторные элементы, что может отрицательно влиять на экспрессию генов. Чтобы предотвратить это распространение, пути метилирования ДНК противопоставляются пассивному и активному деметилированию ДНК. Метилирование ДНК может быть потеряно пассивно с каждым делением клетки, потому что вновь синтезированные цепи ДНК не имеют метилирования ДНК до тех пор, пока они не будут повторно добавлены одним из поддерживающих путей метилирования ДНК. Метилирование ДНК также может активно удаляться в растениях с помощью ДНК-гликозилаз, которые удаляют метилированные цитозины через путь эксцизионной репарации оснований. У Arabidopsis есть четыре белка, ответственных за удаление метилирования ДНК: репрессор молчания 1 (ROS1), Demeter (DME), Demeter-подобный 2 (DML2) и Demeter-подобный 3 (DML3). Эти ДНК-гликозилазы помогают предотвратить распространение метилирования ДНК от мишеней RdDM к активным генам. Потеря активного деметилирования ДНК в тройных мутантах ros1; dml2; dml3 приводит к повсеместному увеличению уровней метилирования ДНК, тогда как эктопическая экспрессия ROS1 приводит к прогрессирующей потере метилирования ДНК во многих локусах, что подчеркивает важность балансировки Активность метилирования и деметилирования ДНК.
Интересно, что экспрессия ДНК-деметилазы ROS1 напрямую связана с активностью RdDM: метилирование ДНК по TE, на которое нацелено RdDM в промоторе ROS1, необходимо для экспрессии ROS1, хотя другие факторы также участвуют в регуляции ROS1. Поскольку экспрессия ROS1 связана с метилированием ДНК в конкретном TE, экспрессия ROS1 также сильно снижена у растений с дефектным RdDM, которые теряют способность метилировать этот TE и другие. Этот общий механизм помогает поддерживать метилирование ДНК гомеостаз путем настройки активности деметилирования ДНК в соответствии с активностью метилирования ДНК, помогая гарантировать, что паттерны метилирования ДНК могут стабильно сохраняться с течением времени.
Схема, изображающая эволюционную консервацию выбранных ортологов субъединиц Pol IV и V в царстве растений. Субъединицы, начинающиеся с NRPD, представляют собой субъединицы Pol IV, субъединицы, начинающиеся с NRPE, являются субъединицами Pol V, а субъединицы, помеченные как NRPD / E, обнаруживаются как в Pol IV, так и в V. Заполненный кружок для субъединицы указывает на то, что ортолог для этой субъединицы был идентифицирован в пределах ассоциированной линии. 
Схема, изображающая эволюционную консервацию выбранных ортологов компонентов пути RdDM в царстве растений. Закрашенный кружок для субъединицы указывает на то, что ортолог для этой субъединицы был идентифицирован в пределах ассоциированной линии. Хотя все эукариоты разделяют три РНК-полимеразы (РНК Pol I, II и III), растения имеют две дополнительные полимеразы, Pol IV и Pol V. И Pol IV, и V имеют эволюционное происхождение, происходящее от Pol II. В других царствах эукариот, в которых отсутствуют эти две специализированные РНК-полимеразы, Pol II транскрибирует предшественников малых РНК, используемых в путях сайленсинга - фактически, транскрипты Pol II также иногда процессируются в мРНК в растениях. Была выдвинута гипотеза, что происхождение как Pol IV, так и Pol V коренится в «бегстве от адаптивного конфликта». Идея состоит в том, что потенциальные противоречия между «традиционной» функцией Pol II и функцией биогенеза малых РНК могут быть сняты путем дублирования Pol II и субфункционализации образующихся множественных РНК-полимераз.
Анализ эволюционного происхождения Pol IV и Pol V до некоторой степени усложняется тем фактом, что каждый фермент фактически состоит по крайней мере из 12 субъединиц. У Arabidopsis thaliana некоторые субъединицы являются общими для Pol IV и Pol V, некоторые являются уникальными для каждой полимеразы, а некоторые являются общими для Pol II, IV и V. Ортологи определенных субъединиц Pol IV и V были обнаружены во всех клонах наземные растения, включая папоротники, печеночники и мхи. Эти данные свидетельствуют в пользу общего происхождения Pol IV и V, восходящего к ранним наземным / сосудистым растениям.
Большая часть работы по выяснению генов и белков, участвующих в пути RdDM, была проведена на Arabidopsis thaliana, модельном покрытосеменном. Однако исследования Pol IV и V, проведенные на кукурузе, показывают некоторые ключевые отличия от Arabidopsis. Pol IV и V кукурузы отличаются друг от друга только одной субъединицей (самой крупной). У Arabidopsis Pol IV и V отличаются друг от друга по трем субъединицам. Однако кукуруза использует набор взаимозаменяемых каталитических субъединиц - две в случае Pol IV и три в случае Pol V, которые обеспечивают дополнительную специализацию функциональности полимеразы. Хотя различия существуют, в целом существует широкое совпадение функций и компонентов RdDM между разными видами покрытосеменных, изученных на сегодняшний день.
Помимо Pol IV и Pol V, большая часть ключевых белков-компонентов RdDM (например, DCL3 и AGO4) имеет ортологи, обнаруженные в каждом классе наземных растений, что подтверждает гипотезу о том, что некоторая форма Путь RdDM возник на ранней стадии в линии растений. Однако функциональность пути RdDM, по-видимому, в значительной степени изменяется между разными видами и линиями растений. Например, в то время как голосеменные имеют функциональный Pol IV и продуцируют небольшие РНК из 24 нуклеотидов, биогенез мРНК внутри голосеменных гораздо более сильно искажен в сторону 21 нуклеотидов, чем 24 нуклеотидов мРНК. Это говорит о том, что канонический RdDM может быть более редким или менее выраженным у голосеменных, чем у покрытосеменных. Сходным образом, хотя ортологи DRM2 обнаружены у различных покрытосеменных, нет известных ортологов DRM2 в других линиях растений. Одна из возможностей состоит в том, что покрытосеменные обладают «наиболее полной» версией пути RdDM, тогда как все другие линии растений обладают надежными и функциональными подмножествами пути. Однако, поскольку почти вся работа по RdDM была проделана на покрытосеменных, также возможно, что альтернативные версии RdDM в других линиях просто еще не были обнаружены, особенно если эти альтернативные версии включают разные белки или белки без четких гомологов у покрытосеменных..
Все эукариотические царства содержат некоторую форму малых РНК. Одним из таких классов мРНК является Piwi-взаимодействующие РНК (piRNA). Как и в случае RdDM, piRNAs в первую очередь функционируют, чтобы нацеливать и заглушать транспозоны, особенно в зародышевой линии. Однако пиРНК обнаруживаются только у животных, они длиннее малых РНК, функционирующих при RdDM (24-32 нуклеотида), и опосредуют свои функции через взаимодействия с другим подклассом белков AGO, подсемейством PIWI, которые отсутствуют у растений. 39>МикроРНК (миРНК) представляют собой еще один класс малых РНК со свойствами сайленсинга. В то время как miRNA находятся в том же диапазоне размеров, что и мРНК RdDM (~ 21 н.), MiRNA связаны с отдельным набором белков Argonaute, которые заставляют замолчать РНК-мишени, инициируя их деградацию или блокируя их последующую трансляцию в белки, вместо того, чтобы рекрутировать DRM2 для добавления метилирования ДНК. к ближайшей ДНК. Как RdDM, так и пути miRNA включают родственные белки из семейств Argonaute и Dicer.
Возможно, наиболее аналогичными путями к RdDM в другом эукариотическом царстве являются sRNA-управляемое подавление транскрипционного гена (TGS) и котранскрипционное молчание генов ( CTGS) у Schizosaccharomyces pombe. У S. pombe TGS управляет метилированием H3K9, приводящим к образованию гетерохроматина, и управляется мРНК, продуцируемой из целевых областей. Подобно каноническому RdDM, этот путь представляет собой петлю положительной обратной связи: мРНК генерируются преимущественно из богатых гетерохроматином областей генома, и эти мРНК направляют добавление метилирования K3K9 для поддержания / распространения гетерохроматина. Между тем, CTGS направляется связанными с AGO1 мРНК, подобными PTGS в растениях, и приводит к ингибированию транскрипции с помощью Pol II, а также к высвобождению Pol II. В отличие от RdDM, TGS и CTGS у S. pombe не зависят от транскрипции из источников, не относящихся к Pol II, и не приводят к добавлению метилирования ДНК. Однако пути S. pombe и RdDM имеют много одинаковых компонентов, таких как РНК-направленные РНК-полимеразы и мРНК, и имеют сходные функции по поддержанию гетерохроматина.
Введение трансгенов в организмы на протяжении десятилетий широко использовалось в исследованиях генетики растений. Однако исследователи часто обнаруживают, что введенные ими трансгены экспрессируются не так сильно, как ожидалось, а иногда даже не экспрессируются вообще - явление, называемое подавлением трансгена. Открытие сайленсинга трансгенов в 1990-х годах вызвало большой интерес к пониманию механизмов, лежащих в основе этого молчания. Исследователи обнаружили, что сайленсинг трансгена был повсеместным, происходил у многих видов (включая Arabidopsis, Tobacco и Petunia) и был связан с повышенным метилированием ДНК вокруг заглушенного трансгена и вокруг него.
Примерно в то же время в 1994 году работа в растениях табака был обнаружен новый путь с участием РНК, приводящий к метилированию ДНК. Исследователи обнаружили, что когда вироиды были введены в растение и интегрированы в геном растения, последовательности вироидов, но не геном хозяина, получили метилирование ДНК. Отложение метилирования над этими чужеродными последовательностями вироидов помогает ингибировать репликацию вироидов и, следовательно, считается представителем механизма защиты растений от патогенов. Данные свидетельствуют о том, что вироидные РНК, продуцируемые во время репликации вироидов, использовались растением в качестве матрицы, помогающей нацеливать метилирование ДНК на последовательности вироидов. Поэтому этот механизм был назван РНК-направленным метилированием ДНК, или RdDM.
RdDM оказался решением загадки трансгена: как вироиды и вирусы, трансгены являются чужеродными последовательностями, и в результате они часто распознаются как иностранные захватчики и нацелены на подавление RdDM и PTGS. Поскольку молчание трансгенов было надежным маркером активности RdDM, исследователи смогли разработать генетический скрининг для выявления мутантов, которые не смогли запустить сайленсинг у трансгенов, аргументируя это тем, что эти гены, вероятно, участвуют в пути RdDM. Эти эксперименты выявили многие части пути, включая РНК Pol IV и V, дайсер-подобные белки, аргонавты и другие.
Первоначально предполагалось участие мРНК в RdDM из-за сходство между RdDM и RNAi, последняя из которых, как недавно было показано, включает малые РНК. Чтобы проверить, участвуют ли мРНК в RdDM, в Arabidopsis и Tobacco были введены шпилечные структуры РНК, комплементарные промотору конкретного гена. Шпильчатые РНК были преобразованы в мРНК, которые были способны запускать добавление метилирования ДНК к целевому промотору и заглушать ген. Это продемонстрировало, что мРНК могут направлять метилирование ДНК в определенные локусы. Более поздние усилия показали, что sRNAs, участвующие в RdDM, имели длину приблизительно 24-26 nt, в то время как sRNAs, связанные с RNAi, имели длину только около 21-22 nt. Вскоре после этого идентификация AGO4 и характеристика его роли в RdDM привели к предсказаниям, позже подтвержденным, что 24 н. МРНК связаны с AGO4 и направляют метилирование ДНК в комплементарные локусы.
Ранние работы по сайленсингу трансгенов и RdDM также идентифицировали SDE4 как необходимый для продукции большинства мРНК, участвующих в RdDM. SDE4 позже будет идентифицирован как самая большая субъединица Pol IV и переименован в NRPD1. Ряд исследований, опубликованных в быстрой последовательности несколькими исследовательскими группами, с использованием как прямого, и обратного генетических подходов, позволили идентифицировать и охарактеризовать Pol IV и Pol V как высокоспециализированные РНК-полимеразы растений. участвует в RdDM. Вскоре после этого было принято соглашение об именах Pol IV / Pol V.
Поскольку механизм, лежащий в основе специфичности последовательности RdDM, хорошо известен, RdDM может быть «обманут» для нацеливания и подавление эндогенных генов высокоспецифическим образом, что имеет ряд потенциальных биотехнологических и биоинженерных приложений. Для запуска метилирования ДНК на основе RdDM и подавления определенных генов можно использовать несколько различных методов. Один метод, называемый индуцированным вирусом сайленсингом гена (VIGS), включает в себя вставку части последовательности промотора желаемого гена-мишени в вирус. Вирус будет воспроизводить фрагмент промоторной последовательности как часть своей собственной РНК, которая в противном случае является чужеродной для растения. Поскольку вирусная РНК является чужеродной, она будет нацелена на PTGS и преобразована в мРНК, некоторые из которых будут комплементарны промотору исходного гена-мишени. Подмножество этих мРНК задействует механизм RdDM в гене-мишени, чтобы добавить метилирование ДНК. В одном исследовании ученые использовали этот метод с разработанным вирусом мозаики огурца, чтобы задействовать RdDM, чтобы заставить замолчать ген, влияющий на пигментацию цветов в петунии, а в другом - на созревание плодов в помидорах. В обоих случаях они показали, что метилирование ДНК было добавлено к локусу, как и ожидалось. У петунии как усиление метилирования ДНК, так и изменения окраски цветков были наследственными, в то время как у томатов наблюдались только частичное молчание и наследуемость. VIGS также использовался, чтобы заставить замолчать локус FLOWERING WAGENINGEN (FWA) у Arabidopsis, в результате чего растения зацвели позже обычного. Это же исследование также показало, что ингибирующий эффект VIGS на FWA и цветение может усиливаться в течение успешных поколений.
Другой метод нацеливания RdDM на желаемый целевой ген включает введение конструкции РНК шпильки, которая является комплементарной к целевому локусу. Шпильчатые РНК содержат инвертированный повтор, который заставляет молекулу РНК образовывать структуру двухцепочечной РНК (дцРНК), называемую шпилькой РНК. Шпилька дцРНК может быть процессирована белками DCL в мРНК, которые комплементарны целевому локусу, запуская RdDM в этом локусе. Этот метод использовался в нескольких исследованиях.
Изменения, вызванные RdDM, иногда могут сохраняться и унаследоваться в течение нескольких поколений без внешнего вмешательства или манипуляций, что позволяет предположить, что RdDM может быть ценным инструментом для целевого редактирования эпигенома. Недавняя работа даже позволила полностью обойти RdDM путем искусственного связывания DRM2 (или других компонентов пути RdDM) непосредственно с конкретными целевыми локусами, используя либо нуклеазы цинковых пальцев, либо CRISPR. В этих экспериментах привязка аппарата RdDM к определенному локусу приводила к усилению метилирования ДНК в целевом сайте, которое часто передавалось по наследству для нескольких поколений, даже после того, как искусственная конструкция была удалена путем скрещивания. Однако для всех этих методов требуется дополнительная работа по минимизации нецелевых эффектов и повышению эффективности метилирования ДНК.
Генетически модифицированные организмы (ГМО) сыграли большую роль в недавних сельскохозяйственных исследованиях и практике, но оказались противоречивыми и столкнулись с нормативными препятствиями при внедрении в некоторых юрисдикциях. ГМО определяются включением «чужого» генетического материала в геном. Обработка растений сконструированными РНК или вирусами, предназначенными для запуска RdDM, не изменяет основную последовательность ДНК генома обработанного растения; изменяется только эпигенетическое состояние частей уже имеющейся последовательности ДНК. В результате эти растения не считаются ГМО. Это привело к попыткам использовать RdDM и другие РНК-опосредованные эффекты для индукции полезных для сельского хозяйства признаков, таких как изменение восприимчивости к патогенам или гербицидам, или ускорение селекции растений за счет быстрого создания благоприятных признаков. Однако, хотя эта область вызывает активный интерес, на данный момент существует несколько широко применяемых приложений.
Эта статья была адаптирована из следующего источника по лицензии CC BY 4.0 () (отчеты рецензентов ): Роберт М. Эрдманн ; Колетт Пикард (2020), «РНК-направленное метилирование ДНК», PLOS Genetics, 16 (10): e1009034, doi : 10.1371 / JOURNAL.PGEN.1009034, PMID 33031395, Wikidata Q100233435
