Войти
Гелитрон - одна из трех групп эукариот класса 2 мобильных элементов (ТЕ), описанный до сих пор. Они представляют собой эукариотические подвижные элементы по типу катящегося круга, которые, как предполагается, транспонируются с помощью механизма репликации по катящемуся кругу через промежуточное соединение одноцепочечной ДНК. Впервые они были обнаружены у растений (Arabidopsis thaliana и Oryza sativa ) и у нематоды Caenorhabditis elegans, а теперь они были идентифицированы у самых разных видов., от простейших до млекопитающих. Гелитроны составляют значительную часть многих геномов, где неавтономных элементов часто больше, чем предполагаемых автономных партнеров. Гелитроны, по-видимому, играют важную роль в эволюции геномов хозяина. Они часто захватывают различные гены-хозяева, некоторые из которых могут эволюционировать в новые гены-хозяева или стать важными для транспозиции Helitron.
Гелитроны были первой группой ТЕ, обнаруженной путем компьютерного анализа последовательностей всего генома. Первые описанные гелитроны назывались Aie, AthE1, Atrep и Basho, которые представляют собой неавтономные гелитроны, обнаруженные в геноме Arabidopsis thaliana, небольшого цветущего растения. Несмотря на эти открытия, классификация гелитронов была неизвестна до 2001 года, когда были обнаружены элементы, кодирующие белок, которые, как предполагалось, были автономными партнерами. Капитонов и Юрка исследовали кодирующую способность гелитронов у A. thaliana, Oryza sativa и Caenorhabditis elegan, используя in silico исследования повторяющейся ДНК этих организмов, компьютерный анализ и моделирование Монте-Карло. Они описали структуру и кодирующий потенциал канонических гелитронов и предложили механизм перемещения по кругу, а также возможность того, что некоторые из кодируемых генов, захваченных от хозяина, теперь используются для репликации. Их исследование генома этих организмов показало, что активность Helitron может вносить вклад в значительную часть (~ 2%) геномов растений и беспозвоночных, в которых они были обнаружены, но степень их распространения в других местах не была ясна.
В 2003 году группа исследователей изучала структуру белков, связанных с гелитронами, и различными кодирующими доменами внутри них, ища элементы, подобные гелитрону, у позвоночных, в частности у рыб-зебр, Danio rerio и рыбы-фугу, Sphoeroides nephelus. Было предсказано, что белки Rep / Helicase будут на 500-700 аминокислот длиннее из-за С-концевого слияния домена с гомологией апуриново-апиримидиновой (AP) эндонуклеазе. Предыдущие филогенетические исследования показали, что AP-эндонуклеаза вложена в кладу Chicken Repeat 1 (CR1) ретротранспозонов с недлинными концевыми повторами (не LTR). Это соотношение свидетельствует о том, что эндонуклеаза AP произошла от вставки ретротранспозона либо поблизости, либо внутри Helitron. Эти исследователи не смогли идентифицировать концы блока Rep / Helicase / Endonuclease Helitron.
В последние годы гелитроны были идентифицированы во всех эукариотических царствах, но их количество геномных копий сильно варьируется даже среди близкородственных видов. Они составляют 1–5% геномной ДНК у различных плодовых мушек, 0–3% у млекопитающих,>0,5% у лягушки. У большинства млекопитающих присутствие Helitron незначительно и ограничивается остатками старых транспозонов, за исключением геномов летучих мышей, которые населены многочисленными молодыми элементами. Однако спустя много лет после описания автономных гелитронов не было опубликовано никаких механистических исследований, и поэтому механизм перемещения по кругу остается хорошо подтвержденной, но еще не проверенной гипотезой.
Структура и возможности кодирования канонических животных и растений Helitron Helitron структурно асимметричны и являются единственным классом транспозонов ДНК, которые не генерируют дупликации сайтов-мишеней во время транспозиции. Канонические гелитроны обычно начинаются с 5 'T (C / T) и заканчиваются нуклеотидами CTRR (чаще всего CTAG, но иногда отмечаются вариации), но не содержат концевых инвертированных повторов. Кроме того, они часто имеют короткую палиндромную последовательность (от 16 до 20 нуклеотидов) шпилькой примерно в 11 п.н. от 3'-конца. Они интегрируются между динуклеотидом хозяина AT. Некоторые семейства гелитронов также несут тандемные повторы, такие как микросателлиты и минисателлиты, которые обычно являются сильно изменяемыми последовательностями.
Большинство гелитронов являются неавтономными элементами и имеют общие концы и другие структурные признаки с автономными гелитронами., но они не кодируют полный набор белков, кодируемых автономными элементами. Основными ферментативными признаками Helitron являются домены инициатора репликации (Rep) и ДНК-геликазы (Hel), которые присутствуют в белке, состоящем из 1000–3000 аминокислот (аа) (Rep / Hel), кодируемых всеми автономные элементы Helitron. Белок Rep / Helicase включает мотивы «цинковые пальцы», домен Rep (который составляет ~ 100 аминокислотных остатков и обладает эндонуклеазной активностью HUH) и геликазу семейства PiF1 с восемью доменами (SuperFamily1), которые универсально консервативны в Helitron. Мотивы, похожие на цинковые пальцы, связаны со связыванием ДНК. Домен Hel с ~ 400 аминокислотами классифицируется как ДНК Hel от 5 'до 3', которая участвует в разрыве и присоединении одноцепочечной ДНК и характеризуется как наличием мотива HUH (два гистидина остатков, разделенных гидрофобным остатком) и мотивом Y (один или два остатка тирозина, разделенных несколькими аминокислотами). Семейство геликаз PiF1 (Hel) обладает 5'-3'-раскручивающей активностью, которая для многих сущностей катящегося круга эта активность кодируется хозяином. Plant Helitrons также кодируют открытую рамку считывания с гомологией с одноцепочечными ДНК-связывающими белками (RPA). Как правило, белки RPA в гелитронах имеют длину 150-500 аминокислот и кодируются несколькими экзонами. Во всех гелитронах домен Rep предшествует домену Hel.
Предлагается транспонировать гелитроны по механизму, аналогичному репликации по катящемуся кругу через одноцепочечную ДНК. промежуточный. Предлагаются две модели механизма транспозиции: согласованная и последовательная. В согласованной модели расщепление и лигирование донорной цепи происходит одновременно, тогда как в последовательной модели они происходят поэтапно. Согласованная модель не требует круговых промежуточных звеньев, хотя они могут возникнуть, если шаг не работает или пропускается во время транспонирования. Последовательная модель отличается тем, что кольцевой промежуточный продукт является обязательным этапом транспозиции, и поскольку до недавнего времени кольцевые промежуточные продукты не были известны для гелитронов, согласованная модель была адаптирована для объяснения транспозиции.
В любом случае с использованием реконструированные транспозоны Helraiser для изучения транспозиции Helitron, было показано, что донорский сайт должен быть двухцепочечным и что одноцепочечных доноров будет недостаточно.
Механизм катящегося круга для транспозиции Helitron и приобретение генов в согласованной модели Helitron может быть автономным или неавтономным. Одна молекула транспозазы расщепляется у донора (первым остатком тирозина (Y1) белка Rep) и сайтов-мишеней (вторым остатком тирозина (Y2)) и связывается с полученными 5'-концами. Свободный 3 'ОН в целевой ДНК атакует связь ДНК-Y1 и образует связь с донорной цепью, что приводит к переносу цепи. Репликация на отщепленном донорском сайте начинается на свободном 3'-ОН, где донорная цепь служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой хозяина, и репликация продолжается с замещением одной цепи гелитрона. Если палиндром и 3'-конец элемента распознаются правильно, расщепление происходит после последовательности CTRR, и одна цепь Helitron переносится на донорский сайт, где репликация ДНК разрешает гетеродуплекс.
а) Плазмида, содержащая гелитрон: ген устойчивости к антибиотику (канамицин) вставлен между левой и правой концевыми последовательностями (LTS и RTS соответственно); б) Круговой промежуточный продукт транспозиции: концевые последовательности соединены вместе (серая стрелка указывает на промотор гена) В 2016 году было опубликовано одно из первых механистических исследований транспозиции гелитрона, чтобы пролить свет на различные этапы транспозиции. Основываясь на согласованной последовательности, он реконструировал вероятного предка семейства гелитронов Helibat, присутствующего в геноме маленькой коричневой летучей мыши (Myotis Lucifugus ), единственной группы млекопитающих, обладающих значительным количеством гелитронов в своем теле. геном. Этот активный транспозон был вставлен в плазмиду , действующую как донор гелитрона. Ген устойчивости к антибиотикам был включен между двумя концевыми последовательностями гелитрона, чтобы обеспечить изоляцию клеток, в которых произошла транспозиция.
Во время транспозиции гелитрона образуется кольцевой промежуточный продукт, который выделяется в клетках, трансфицированных плазмидой. Он образуется путем соединения концевых концов и предлагает модель транспозиции по типу катящегося круга, в ходе которой расщепление донорной и целевой цепей не происходит одновременно, поскольку однониточная кольцевая ДНК сначала формируется с одной цепью. нитей гелитрона.
Эта модель подтверждается тем фактом, что делеция одного из двух тирозинов (Y727) домена Rep, который, как считается, участвует в расщеплении цепей, на самом деле не влияет на эффективность транспозиции гелитрона. Потребуется только один из триозинов, чтобы обеспечить двухэтапный процесс: 1) расщепление донорной ДНК и 2) интеграцию в целевой сайт..
Донорная последовательность (черный) и целевая последовательность (синий); helitron разделен на три части (LTS синим цветом, последовательность кодирования серым цветом и RTS фиолетовым цветом). а) тирозин белка Rep-Hel отщепляет 5’-конец LTS в донорной последовательности; б) с использованием активности геликазы от 5 ’к 3’, Rep-Hel перекатывается на 3 ’конец RTS; c) расщепление 3 ’конца после обнаружения RTS; г) соединение концевых последовательностей и образование промежуточного круга; д) расщепление целевой цепи и интеграция гелитрона после пассивного разрешения .
Наличие смежных экзонов и интронов внутри хозяина ДНК, переносимая Helitrons, предполагала механизм приобретения, основанный на ДНК. Было предложено, чтобы захват гена Helitron происходил поэтапно или последовательно, т.е. захват гена происходит во время одной транспозиции, а захват второго гена происходит во время последующего события транспозиции. Пошаговый захват приведет к появлению гелитронов, содержащих фрагменты генов из разных мест. Модель последовательного захвата может объяснить гелитроны, несущие несколько фрагментов генов, наблюдаемые у других организмов. Для объяснения механизма захвата генов на уровне ДНК в гелитронах предложены три основные модели.
Также известна как «преобразовательная» или «сквозная» модель 1 (RTM1). Транспозиция инициируется на 5'-конце, и захват гена происходит, если пропущен 3'-сигнал терминации. Загадочный нисходящий палиндром мог бы предоставить новый терминатор, если бы нормальный терминатор был пропущен и вся промежуточная последовательность была бы захвачена. В этом отношении гелитроны можно рассматривать как машины для перетасовки экзонов. Поскольку случайная последовательность обеспечивает новый сигнал терминации, эта модель не требует высокой плотности гелитронов в геноме.
Действительно, в слияниях одностороннего типа вставленный фрагмент донорской ДНК фланкирован на одном конце (константном конце) IRR, а на другом конце последовательностью CTTG или GTTC, присутствующей в доноре ( вариабельный конец) способом, который обычно приводит к множественным тандемным вставкам донорной плазмиды или захвату фланкирующей последовательности в целевом сайте. Эта неспособность распознать сигнал терминации для транспозиции Helitron может привести к тому, что ДНК, фланкирующая 3'-конец Helitron, также переносится вместе с Helitron на донорский сайт (захват гена). Возможно, именно так Helitrons приобрели дополнительные кодирующие последовательности. Несмотря на эту гипотезу, необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы проверить механизм транспозиции.
Также известна как «сквозная» модель 2 (RTM2). В этой модели транспозиция инициируется на 5'-конце Helitron, и если 3'-конец этого Helitron отсутствует, поэтому транспозиция завершается на следующем 3'-конце Helitron в правильной ориентации, происходит захват гена. В результате улавливается вся промежуточная последовательность.
В этой модели части генов или некодирующие области могут случайно служить матрицами во время репарации двухцепочечных разрывы (DSB), возникающие в гелитронах при их перемещении. Восстановление DSB с помощью негомологичных концевых соединений происходит чаще у растений и млекопитающих, чем восстановление путем гомологичной рекомбинации, и часто сопровождается вставками «ДНК-наполнителя» длиной 100–4000 п.н., скопированных с разнородной геномной или внехромосомной ДНК. регионов в DSB. Эта модель предсказывает, что области микрогомологии от 2 до 8 пар оснований существуют между областями, которые фланкируют DSB в Helitron и которые фланкируют исходную последовательность хозяина, захваченную Helitron.
Есть также другие модели механизма захвата гена, предложенные для гелитронов: модель сайт-специфической рекомбинации, которая основана на общих чертах между гелитронами и интегронами ; Захват перемещаемых элементов, основанный на интеграции TE посредством транспозиции в другие TE, также называемый вложением TE. Несмотря на все эти предложенные модели, не хватает примеров, чтобы ограничить механизм захвата гена одной моделью. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять молекулярный механизм захвата генов и то, как он способствует выживанию гелитронов.
Доказательства, подтверждающие модели «сквозного чтения», по-видимому, заключаются в относительной недостаточной важности 3 'RTS по сравнению с 5' LTS: удаление LTS приводит к серьезному снижению эффективности helitron, в то время как полная делеция RTS все еще приводит к значительной транспозиции, несмотря на уменьшенное количество копий. RTS указывает белку Rep-Hel конец гелитрона и, следовательно, конец транспозиции. Вся эта информация заключается в структуре шпильки, образованной палиндромной последовательностью ДНК на 3'-конце. Такая небольшая структура, вероятно, со временем изменится, что позволит обойти конец гелитрона во время его транспозиции и захватить последовательность соседнего гена.
Гелитроны, как и все другие ТЕ, являются потенциальными инсерционными мутагенами. Они могут быть вставлены в промоторную область гена, что приводит к отмене измеримых транскриптов и наблюдаемых фенотипов. В некоторых случаях было замечено, что вставка Helitron обеспечивает регуляторные мотивы, необходимые для инициации транскрипции. Исследователи представили доказательства того, что Helitrons внесли предполагаемые промоторы, экзоны, сайты сплайсинга, сайты полиаденилирования и сайты связывания микроРНК в транскрипты, которые в остальном сохраняются у млекопитающих. Гелитроны управляют экспрессией и обеспечивают de novo регуляторные элементы, такие как CAAT-бокс, GCbox, мотив октамера и сайты TATA-бокса. Гелитроны также могут изменять длину и последовательность как 5'-UTR, так и 3'-UTR кодирующих транскриптов. Еще один способ, которым Helitrons может контролировать экспрессию генов, - это участие в новых вариантах сплайсинга, продвижение альтернативного сплайсинга и обеспечение скрытых сайтов сплайсинга. Сообщалось о ряде спонтанных мутаций в растениях, которые вызваны интронными вставками Helitron, которые приводят к генерации видов химерных транскриптов.
Конвейер для полногеномной идентификации кандидатов Helitron и их проверка Атипичная структура, отсутствие модификации сайта-мишени и неоднородность последовательности гелитронов затрудняют автоматическую идентификацию гелитронов. Для анализа в масштабе всего генома для поиска канонических гелитронов применялись два подхода: подходы идентификации повторений De novo, которые можно использовать для построения консенсусных библиотек всех повторяющихся последовательностей, но подходы поиска повторений De novo будут определять только гелитроны, которые присутствуют в множественные относительно однородные копии в геноме. Следовательно, младшие копии и старые гелитроны будут иметь тенденцию быть фрагментированными и иметь плохо определенные концы. Эти подходы ограничены качеством сборки генома и однородностью повторов. Другой подход основан на структуре, основанной на структурных особенностях канонических Helitron и использующих такие программы, как Helitronfinder, HelSearch, Helraizer и HelitronScanner. Поскольку эти программы обучаются на известных элементах Helitron, они могут быть неэффективными при выявлении расходящихся семейств и генерируют много ложных срабатываний. Этот подход не создает консенсусных последовательностей кандидатов-гелитронов, что приводит к большим наборам данных.
Чувствительность подхода на основе структуры (правильно идентифицировано / (правильно идентифицировано + ложноотрицательные)) составляет 93%, а специфичность (правильно идентифицировано / (правильно определено + ложные срабатывания)) составляет 99%. Есть несколько причин, по которым все другие методы открытия Helitron были менее чувствительными и / или более подверженными ошибкам: поиск на основе белка Rep / геликазы дает большое количество ложноотрицательных результатов, потому что большинство Helitron являются неавтономными элементами. Поиск на основе сходства не выявит новых семейств и, следовательно, будет плохо работать в недавно изученных геномах. Поиск на основе повторов требует обширного ручного курирования для идентификации семейств Helitron, что является непосильной задачей для больших геномов со значительным повторением ДНК. На основе общей чувствительности и специфичности структурный подход к идентификации элементов Helitron является весьма успешным и особенно полезным для идентификации элементов Helitron в недавно охарактеризованном геноме. Однако, поскольку для совмещения необходимы как минимум 2 копии, единичные копии Helitron будут упущены.
Наследование: Анализ всего генома показал, что большая часть Helitron как правило, совсем недавно. Молодой возраст семейств Helitron, конечно, зависит от тщательно изученных геномов, которые в основном состоят из растений и насекомых, у которых неограниченный период полураспада ДНК (среднее время, в течение которого теряется половина ДНК, не законсервированной для функции). довольно быстро. В отличие от других транспозонов ДНК, гелитроны некоторых видов, как сообщается, проявляют долгосрочную активность, вероятно, из-за механизма транспозиции или неспособности хозяина распознавать гелитроны из-за гетерогенности последовательности или захвата гена хозяина. В отличие от относительно более быстрого неограниченного периода полураспада ДНК (2,5–14 млн лет) геномов растений и насекомых, период полураспада ДНК млекопитающих оценивается гораздо медленнее (884 млн лет), что наряду с минимальными требованиями транспозиции Helitron и медленная скорость разложения у млекопитающих вызвали эту модель вертикальной стойкости.
Горизонтальный перенос: Влияние горизонтального переноса (ГТ) мобильных элементов может быть значительным из-за их мутагенного потенциала, присущей им подвижности и изобилия. Исследователи обнаружили доказательства повторяющейся HT четырех различных семейств Helitron у беспрецедентного множества организмов, включая млекопитающих, рептилий, рыб, беспозвоночных и вирусы насекомых. Гелитроны, присутствующие у этих видов, имеют неоднородное распределение и тесно связаны (80–98% идентичности последовательностей), несмотря на большое время расхождения между хозяевами. В отличие от генов, гелитроны, перенесенные горизонтально в новые геномы хозяина, могут амплифицироваться, в некоторых случаях достигая нескольких сотен копий и представляющих значительную часть генома. Поскольку известно, что гелитроны часто захватывают и амплифицируют фрагменты генов, HT этой уникальной группы ДНК-транспозонов может привести к горизонтальному переносу генов и вызвать резкие сдвиги в траектории эволюции генома.
Два разных сценария описывают наиболее вероятную судьбу гена-хозяина, захваченного Helitron'ами: 1. Захваченный ген был бы разрушен множественными мутациями, если бы он не обеспечивал селективное преимущество транспозонов. 2. Он будет сохраняться как ген, связанный с исходным геном хозяина, если его захват благоприятен для транспозона, который переносится хозяином. Гелитроны, как и большинство других мобильных элементов в геномах A. thaliana и C. elegans, присутствуют в геномах во множестве сильно различающихся семейств. Учитывая молодой возраст этих семей и степень консервативности белков, маловероятно, что наблюдаемое расхождение является результатом мутаций, накопленных транспозонами, интегрированными в геном хозяина, что доказывает, что гелитроны работают как мощный инструмент эволюции. Они задействовали гены хозяина, модифицировали их до такой степени, которая недостижима для менделевского процесса, и умножили их в геномах хозяина.
Хотя обычно это согласились с тем, что гелитроны являются транспозонами RC, и благодаря многочисленным исследованиям была доказана роль транспозиции гелитронов в дупликации генов и формировании генетической архитектуры, но ни различные механизмы, с помощью которых это происходит, ни частота не до конца понятны. На данный момент даже неясно, инициирует или завершает 3'-конец транспозона Helitron репликативную транспозицию Helitron. Важным шагом к исследованию этого механизма могло бы стать выделение автономных Helitron active in vitro и in vivo. Это можно сделать путем компьютерной идентификации полных молодых гелитронов. В ближайшем будущем подробные компьютерные исследования последовательностей позволят исследователям понять эволюционную историю гелитронов, а также их механизм захвата генов и их общее значение для эволюции генов.
