Войти
В биологии перепрограммирование относится к стиранию и ремоделированию эпигенетических меток, таких как метилирование ДНК, во время развития млекопитающих или в культуре клеток. Такой контроль также часто связан с альтернативными ковалентными модификациями гистонов.
Перепрограммирование, которое является как крупномасштабным (от 10% до 100% эпигенетических меток), так и быстрым (от часов до нескольких дней), происходит на трех стадиях жизни млекопитающих. Почти 100% эпигенетических меток перепрограммировать в двух коротких периодов в начале развития после оплодотворения в качестве яйцеклетку с помощью спермы. Кроме того, почти 10% метилирований ДНК в нейронах гиппокампа могут быстро изменяться во время формирования сильной памяти о страхе.
После оплодотворения у млекопитающих паттерны метилирования ДНК в значительной степени стираются, а затем восстанавливаются во время раннего эмбрионального развития. Почти все родительские метилирования стираются, сначала во время раннего эмбриогенеза, а затем в гаметогенезе, причем каждый раз происходит деметилирование и реметилирование. Деметилирование в раннем эмбриогенезе происходит в доимплантационном периоде. После того, как сперматозоид оплодотворяет яйцеклетку с образованием зиготы, происходит быстрое деметилирование ДНК отцовской ДНК и более медленное деметилирование материнской ДНК до образования морулы, которая почти не имеет метилирования. После образования бластоцисты может начаться метилирование, а с образованием эпибласта происходит волна метилирования до стадии имплантации эмбриона. Другой период быстрого и почти полного деметилирования происходит во время гаметогенеза в первичных половых клетках (PGCs). За исключением PGCs, на стадии после имплантации паттерны метилирования в соматических клетках зависят от стадии и ткани с изменениями, которые предположительно определяют каждый индивидуальный тип клеток и сохраняются стабильно в течение длительного времени.
Уровни метилирования во время раннего эмбрионального развития мышей. Геном сперматозоидов мыши на 80–90% метилирован по сайтам CpG в ДНК, что составляет около 20 миллионов метилированных сайтов. После оплодотворения отцовская хромосома почти полностью деметилируется за шесть часов в результате активного процесса до репликации ДНК (синяя линия на рисунке). В зрелом ооците метилировано около 40% его сайтов CpG. Деметилирование материнской хромосомы в основном происходит за счет блокирования действия метилирующих ферментов на ДНК материнского происхождения и за счет разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). Морулы (на стадии 16 клеток), имеет только небольшое количество метилирования ДНК (черная линия на рисунке). Метилирование начинает усиливаться через 3,5 дня после оплодотворения в бластоцисте, а затем происходит большая волна метилирования на 4,5-5,5 дня в эпибласте, переходя от 12% до 62% метилирования и достигая максимального уровня после имплантации в матку. К седьмому дню после оплодотворения новообразованные первичные половые клетки (PGC) в имплантированном эмбрионе отделяются от оставшихся соматических клеток. На данный момент PGCs имеют примерно такой же уровень метилирования, что и соматические клетки.
Новообразованные первичные половые клетки (PGC) в имплантированном эмбрионе происходят от соматических клеток. На данный момент PGC имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют от эпибласта к гребню гонад. Теперь клетки быстро размножаются и начинают деметилирование двумя волнами. В первой волне деметилирование происходит путем репликативного разбавления, но во второй волне деметилирование происходит в активном процессе. Вторая волна приводит к деметилированию определенных локусов. В этот момент геномы PGC демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди любых клеток за весь жизненный цикл [в эмбриональный день 13,5 (E13.5), см. Второй рисунок в этом разделе].
Динамика метилирования ДНК во время эмбрионального развития мыши После оплодотворения некоторые клетки новообразованного эмбриона мигрируют к зародышевому гребню и в конечном итоге станут половыми клетками (сперматозоидами и ооцитами) следующего поколения. Из-за феномена геномного импринтинга материнские и отцовские геномы по-разному маркируются и должны быть правильно перепрограммированы каждый раз, когда они проходят через зародышевую линию. Следовательно, во время процесса гаметогенеза первичные зародышевые клетки должны иметь свои оригинальные паттерны метилирования двупародительской ДНК, стертые и восстановленные в зависимости от пола передающего родителя.
После оплодотворения отцовский и материнский геномы деметилируются, чтобы стереть их эпигенетические сигнатуры и приобрести тотипотентность. Здесь наблюдается асимметрия: мужской пронуклеус подвергается быстрому и активному деметилированию. Тем временем женский пронуклеус пассивно деметилируется во время последовательных делений клеток. Процесс деметилирования ДНК включает эксцизионную репарацию оснований и, вероятно, другие механизмы, основанные на репарации ДНК. Несмотря на глобальный характер этого процесса, существуют определенные последовательности, которые его избегают, такие как дифференциально метилированные области (DMRS), связанные с импринтированными генами, ретротранспозонами и центромерным гетерохроматином. Повторное метилирование необходимо для дифференциации эмбриона в полноценный организм.
Было показано, что манипуляции с эмбрионами перед имплантацией in vitro нарушают паттерны метилирования в импринтированных локусах и играют решающую роль у клонированных животных.
Области мозга, участвующие в формировании памяти Обучение и память имеют уровни постоянства, отличные от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые являются временными по своей природе. Обучение и память могут накапливаться медленно (таблица умножения) или быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды их можно использовать для сознательного использования на долгое время. Крысы, подвергшиеся контекстуальному условию страха, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 ч после тренировки было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крыс дифференциально метилированы. Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после тренировки, причем более 500 генов были деметилированы. В области гиппокампа мозга сначала сохраняются контекстные воспоминания о страхе (см. Рисунок мозга в этом разделе), но это хранилище временное и не остается в гиппокампе. У крыс условное кондиционирование страха отменяется, когда гиппокамп подвергается гиппокампэктомии всего через 1 день после кондиционирования, но крысы сохраняют значительную долю контекстного страха, когда возникает длительная задержка (28 дней) между временем кондиционирования и временем гиппокампэктомии.
Для перепрограммирования метилома ДНК требуются три молекулярные стадии. Этап 1: Набор. Ферменты, необходимые для репрограммирования, привлекаются к участкам генома, которые требуют деметилирования или метилирования. Этап 2: Реализация. Происходят начальные ферментативные реакции. В случае метилирования это короткий этап, который приводит к метилированию цитозина до 5-метилцитозина. Этап 3: эксцизионная репарация ДНК. Промежуточные продукты деметилирования катализируются специфическими ферментами пути репарации ДНК с вырезанием оснований, которые в конечном итоге восстанавливают цистозин в последовательности ДНК.
Деметилирование 5-метилцитозина. Деметилирование 5-метилцитозина (5mC) в ДНК нейрона. Согласно обзору 2018 года, в нейронах мозга 5mC окисляется диоксигеназой TET с образованием 5-гидроксиметилцитозина (5hmC). В последовательных этапах фермент TET дополнительно гидроксилирует 5hmC с образованием 5-формилцитозина (5fC) и 5-карбоксилцитозина (5caC). Тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) распознает промежуточные основания 5fC и 5caC и расщепляет гликозидную связь, в результате чего образуется апиримидиновый сайт (AP-сайт). В альтернативном пути окислительного дезаминирования 5hmC может подвергаться окислительному дезаминированию с помощью комплекса редактирования мРНК цитидиндезаминазы / аполипопротеина B (AID / APOBEC), индуцируемого активностью, с образованием 5-гидроксиметилурацила (5hmU). 5mC также можно преобразовать в тимин (Thy). 5hmU может расщепляться TDG, однонитевой селективной монофункциональной урацил-ДНК-гликозилазой 1 (SMUG1), Nei-подобной ДНК-гликозилазой 1 (NEIL1) или метил-CpG-связывающим белком 4 (MBD4). AP-сайты и несовпадения T: G затем восстанавливаются ферментами эксцизионной репарации оснований (BER) с образованием цитозина (Cyt). Рисунок в этом разделе указывает на центральную роль десяти-одиннадцати транслокационных метилцитозиндиоксигеназ (TET) в деметилировании 5-метилцитозина с образованием цитозина. Как было сделано в 2018 году, 5mC очень часто первоначально окисляется TET-диоксигеназами с образованием 5-гидроксиметилцитозина (5hmC). На последовательных этапах (см. Рисунок) ферменты ТЕТ дополнительно гидроксилируют 5hmC с образованием 5-формилцитозина (5fC) и 5-карбоксилцитозина (5caC). Тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) распознает промежуточные основания 5fC и 5caC и вырезает гликозидную связь, в результате чего образуется апиримидиновый сайт (AP-сайт). В альтернативном пути окислительного дезаминирования 5hmC может быть окислительно дезаминирован APOBEC (AID / APOBEC) дезаминазами с образованием 5-гидроксиметилурацила (5hmU) или 5mC может быть преобразован в тимин (Thy). 5hmU может быть расщеплен TDG, SMUG1, NEIL1 или MBD4. AP-сайты и несовпадения T: G затем восстанавливаются ферментами эксцизионной репарации оснований (BER) с образованием цитозина (Cyt).
Изоформы ферментов TET включают по крайней мере две изоформы TET1, одну из TET2 и три изоформы TET3. Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, фактически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и примордиальными зародышевыми клетками (PGCs). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере, у мышей, возникает в результате использования альтернативного промотора, который приводит к короткому транскрипту и усеченному белку, обозначенному TET1. Изоформы TET3 - это полноразмерная форма TET3FL, короткий вариант сплайсинга TET3s и форма, которая встречается в ооцитах и нейронах, обозначенная TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и нейронах и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в клетках любого другого типа или в тканях взрослых мышей. В то время как экспрессия TET1 едва ли может быть обнаружена в ооцитах и зиготах, а TET2 выражается только умеренно, вариант TET3o TET3 показывает чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на стадии 2 клеток. Возможно, что TET3o, с высоким содержанием нейронов, ооцитов и зигот на стадии одной клетки, является основным ферментом TET, используемым, когда в этих клетках происходит очень крупномасштабное быстрое деметилирование.
В ферменты TET не специфически связываются с 5-метилцитозином кроме случаев, когда на работу. Без рекрутирования или нацеливания TET1 преимущественно связывается с высокими промоторами CG и CpG-островками (CGI) по всему геному за счет своего домена CXXC, который может распознавать неметилированные CGI. TET2 не имеет сродства к 5-метилцитозину в ДНК. Домен CXXC полноразмерного TET3, который является преобладающей формой, экспрессируемой в нейронах, наиболее сильно связывается с CpG, где C был преобразован в 5-карбоксицитозин (5caC). Однако он также связывается с неметилированными CpG.
Инициирование деметилирования ДНК по сайту CpG. Во взрослых соматических клетках метилирование ДНК обычно происходит в контексте динуклеотидов CpG ( сайты CpG ), образуя 5-метилцитозин- pG (5mCpG). Реактивные формы кислорода (АФК) могут атаковать гуанин в динуклеотидном сайте, образуя 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG), что приводит к образованию динуклеотидного сайта 5mCp-8-OHdG. База эксцизионной репарации фермента OGG1 цели 8-OHdG и связывается с поражением без немедленного удаления. OGG1, присутствующий в сайте 5mCp-8- OHdG, рекрутирует TET1, а TET1 окисляет 5mC, соседний с 8-OHdG. Это инициирует деметилирование 5mC, как показано на предыдущем рисунке. Чтобы фермент TET инициировал деметилирование, он должен сначала быть задействован в метилированном сайте CpG в ДНК. Два из белков, которые, как показано, привлекают фермент TET к метилированному цитозину в ДНК, - это OGG1 (см. Рисунок «Инициирование демилирования ДНК») и EGR1.
Оксогуанингликозилаза (OGG1) катализирует первую стадию эксцизионной репарации оснований окислительно поврежденного основания 8-OHdG. OGG1 находит 8-OHdG, скользя по линейной ДНК на 1000 пар оснований ДНК за 0,1 секунды. OGG1 очень быстро находит 8-OHdG. Белки OGG1 связываются с окислительно поврежденной ДНК с половинным максимальным временем около 6 секунд. Когда OGG1 находит 8-OHdG, он меняет конформацию и образует комплексы с 8-OHdG в связывающем кармане OGG1. OGG1 не сразу удаляет 8-OHdG. Половина максимального удаления 8-OHdG занимает около 30 минут в клетках HeLa in vitro или около 11 минут в печени облученных мышей. Окисление ДНК реактивными формами кислорода преимущественно происходит по гуанину в метилированном сайте CpG из-за пониженного потенциала ионизации оснований гуанина, соседних с 5-метилцитозином. TET1 связывает (рекрутируется) OGG1, связанный с 8-OHdG (см. Рисунок). Это, вероятно, позволяет TET1 деметилировать соседний метилированный цитозин. Когда эпителиальные клетки молочной железы человека (MCF-10A) обрабатывали H 2 O 2, содержание 8-OHdG увеличивалось в ДНК в 3,5 раза, и это вызывало крупномасштабное деметилирование 5-метилцитозина примерно до 20% от его исходного уровня в ДНК.
Белок 1 реакции раннего роста гена ( EGR1 ) представляет собой ген немедленного раннего развития (IEG). Определяющей характеристикой ИЭГ является быстрое и временное повышение - в течение нескольких минут - уровней их мРНК, независимо от синтеза белка. EGR1 может быстро индуцироваться нейрональной активностью. Во взрослом возрасте EGR1 широко экспрессируется в головном мозге, поддерживая исходные уровни экспрессии в нескольких ключевых областях мозга, включая медиальную префронтальную кору, полосатое тело, гиппокамп и миндалевидное тело. Это выражение связано с контролем познания, эмоциональной реакцией, социальным поведением и чувствительностью к вознаграждению. EGR1 связывается с ДНК в сайтах с мотивами 5'-GCGTGGGCG-3 'и 5'-GCGGGGGCGG-3', и эти мотивы встречаются в основном в промоторных областях генов. Короткая изоформа TET1s экспрессируется в головном мозге. EGR1 и TET1 образуют комплекс, опосредованный C-концевыми областями обоих белков, независимо от ассоциации с ДНК. EGR1 рекрутирует TET1 в области генома, фланкирующие сайты связывания EGR1. В присутствии EGR1, TET1s способны к локус-специфическому деметилированию и активации экспрессии нижестоящих генов, регулируемых EGR1.
Перепрограммирование также можно вызвать искусственно путем введения экзогенных факторов, обычно факторов транскрипции. В этом контексте это часто относится к созданию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из зрелых клеток, таких как взрослые фибробласты. Это позволяет производить стволовые клетки для биомедицинских исследований, таких как исследования методов лечения стволовыми клетками, без использования эмбрионов. Это осуществляется путем трансфекции генов, связанных со стволовыми клетками, в зрелые клетки с использованием вирусных векторов, таких как ретровирусы.
Первым человеком, успешно продемонстрировавшим репрограммирование, был Джон Гэрдон, который в 1962 году продемонстрировал, что дифференцированные соматические клетки могут быть перепрограммированы обратно в эмбриональное состояние, когда ему удалось получить плавающих головастиков после переноса дифференцированных кишечных эпителиальных клеток в энуклеированные яйца лягушки. За это достижение он получил Нобелевскую премию по медицине 2012 года вместе с Шинья Яманака. Яманака был первым, кто продемонстрировал (в 2006 г.), что этот процесс переноса ядра соматической клетки или процесс репрограммирования на основе ооцитов (см. Ниже), открытый Гурдоном, может повторяться (у мышей) с помощью определенных факторов ( Oct4, Sox2, Klf4 и c. -Myc ) для создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Также использовались другие комбинации генов.
Свойства клеток, полученных после репрограммирования, могут значительно различаться, особенно среди ИПСК. Факторы, приводящие к изменению характеристик репрограммирования и функциональных характеристик конечных продуктов, включают генетический фон, источник ткани, стехиометрию фактора репрограммирования и стрессоры, связанные с культурой клеток.
Ооцита может перепрограммировать взрослое ядро в зачаточное состояние после переноса ядер соматических клеток, так что новый организм может развиваться из такой клетки.
Репрограммирование отличается от развития соматического эпитипа, поскольку соматические эпитипы потенциально могут быть изменены после того, как организм выйдет из стадии развития. Во время переноса ядра соматической клетки ооцит выключает тканеспецифические гены в ядре соматической клетки и снова включает гены, специфичные для эмбриона.
