Войти
Ферменты ТЕТ представляют собой семейство транслокаций десять-одиннадцать (ТЕТ) метилцитозин диоксигеназы. Они способствуют деметилированию ДНК. 5-Метилцитозин (см. Первый рисунок) представляет собой метилированную форму ДНК основания цитозина (C), которая часто регулирует транскрипцию гена и выполняет несколько других функций в геноме.
метилирование ДНК - это добавление метильной группы к ДНК, которое происходит в цитозине. На изображении показано основание с одним кольцом цитозина и метильная группа, добавленные к 5-му углероду. У млекопитающих метилирование ДНК происходит почти исключительно в цитозине, за которым следует деметилирование гуанина.ферментами TET (см. Второй рисунок), что может изменить регуляцию транскрипции. Ферменты TET катализируют гидроксилирование ДНК 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) и могут дополнительно катализировать окисление 5hmC до 5- формилцитозин (5fC), а затем до 5-карбоксицитозина (5caC). 5fC и 5caC могут быть удалены из последовательности оснований ДНК с помощью эксцизионной репарации оснований и заменены на цитозин в последовательности оснований.
Деметилирование 5-метилцитозина. Деметилирование 5-метилцитозина (5mC) в ДНК нейронов. Ферменты TET играют центральную роль в деметилировании ДНК, необходимом во время эмбриогенеза, гаметогенеза, памяти, обучения, зависимости и восприятие боли.
Три связанных Гены TET, TET1,, TET2 и TET3 кодируют соответственно три родственных белка млекопитающих TET1, TET2 и TET3. Все три белка обладают 5mC оксидазной активностью, но различаются по архитектуре доменов. Белки TET представляют собой большие (~ 180–230 кДа) многодоменные ферменты. Все белки TET содержат консервативный домен двухцепочечной β-спирали (DSBH), богатый цистеином домен и сайты связывания для кофакторов Fe (II) и 2-оксоглутарата (2-OG), которые вместе образуют центральную каталитическую область в конец C. В дополнение к их каталитическому домену, полноразмерные белки TET1 и TET3 имеют N-концевой домен цинкового пальца CXXC, который может связывать ДНК. В белке TET2 отсутствует домен CXXC, но ген IDAX, соседний с геном TET2, кодирует белок CXXC4. Считается, что IDAX играет роль в регуляции активности TET2, облегчая его рекрутирование в неметилированные CpG.
Три гена TET экспрессируются как разные изоформы, включая по меньшей мере две изоформы TET1, три из TET2 и три из TET3. Различные изоформы генов TET экспрессируются в разных клетках и тканях. Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, фактически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и примордиальными зародышевыми клетками (PGC). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере, у мышей, возникает в результате использования альтернативного промотора, что приводит к короткому транскрипту и усеченному белку, обозначенному TET1. Три изоформы TET2 возникают из разных промоторов. Они экспрессируются и активны в эмбриогенезе и дифференцировке гемопоэтических клеток. Изоформы TET3 - это полноразмерная форма TET3FL, короткий вариант сплайсинга TET3s и форма, которая встречается в ооцитах, обозначенная TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и на одноклеточной стадии зиготы и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в тестируемых клетках любого другого типа или в ткани взрослой мыши. В то время как экспрессия TET1 едва ли может быть обнаружена в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется только умеренно, вариант TET3o TET3 демонстрирует чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на стадии 2 клеток. Похоже, что TET3o с высоким содержанием ооцитов и зигот на стадии одной клетки является основным ферментом TET, используемым, когда почти 100% быстрое деметилирование происходит в отцовском геноме сразу после оплодотворения и до начала репликации ДНК (см. деметилирование ДНК ).
Многие различные белки связываются с конкретными ферментами TET и рекрутируют TET в определенные участки генома. В некоторых исследованиях необходим дальнейший анализ, чтобы определить, опосредует ли взаимодействие само по себе рекрутирование, или вместо этого взаимодействующий партнер помогает установить благоприятную среду хроматина для связывания TET. Клетки, истощенные по TET1 и TET2, выявили различные целевые предпочтения этих двух ферментов, при этом промоторы, предпочитающие TET1, и тела генов с высокой экспрессией и энхансерами, предпочитающие TET2.
Инициирование деметилирования ДНК при a CpG-сайт Три ДНК-метилтрансферазы (DNMT) млекопитающих демонстрируют сильное предпочтение добавлению метильной группы к 5-м атомам углерода в цитозине, где цитозин За нуклеотидом следует нуклеотид гуанин в линейной последовательности из оснований вдоль его 5 '→ 3' направления (при Сайты CpG ). Это формирует сайт 5mCpG. Более 98% метилирования ДНК происходит на сайтах CpG в соматических клетках млекопитающих. Таким образом, ферменты TET в значительной степени инициируют деметилирование по сайтам 5mCpG.
Оксогуанингликозилаза (OGG1) является одним из примеров белка, который рекрутирует фермент TET. TET1 может действовать на 5mCpG, если ROS сначала воздействует на гуанин с образованием 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG или его таутомера 8-оксо-dG), в результате чего получается динуклеотид 5mCp-8-OHdG (см. рисунок). После образования 5mCp-8-OHdG фермент эксцизионной репарации оснований OGG1 связывается с повреждением 8-OHdG без немедленного удаления (см. Рисунок). Присоединение OGG1 к сайту 5mCp-8-OHdG рекрутирует TET1, позволяя TET1 окислять 5mC, соседний с 8-OHdG. Это инициирует путь деметилирования.
Процессивность TET можно рассматривать на трех уровнях: физическом, химическом и генетическом. Физическая процессивность относится к способности белка TET скользить по ДНК от одного сайта CpG к другому. Исследование in vitro показало, что связанный с ДНК ТЕТ не предпочтительно окисляет другие сайты CpG на той же молекуле ДНК, что указывает на то, что ТЕТ физически не является процессивным. Химическая процессивность относится к способности TET катализировать итеративное окисление 5mC до 5caC без высвобождения его субстрата. Похоже, что TET может работать как через химически процессивные, так и непроцессивные механизмы в зависимости от условий реакции. Генетическая процессивность относится к генетическому результату TET-опосредованного окисления в геноме, как показано картированием окисленных оснований. В эмбриональных стволовых клетках мыши многие участки генома или сайты CpG модифицированы так, что 5mC заменяется на 5hmC, но не на 5fC или 5caC, тогда как во многих других сайтах CpG 5mCs модифицируются на 5fC или 5caC, но не на 5hmC, предполагая, что 5mC процессируется до различных состояний в разных областях генома или сайтах CpG.
Превращение 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин ферментом TET плюс α-кетоглутарат и Fe (II) Ферменты ТЕТ представляют собой диоксигеназы из семейства альфа-кетоглутарат-зависимых гидроксилаз. Фермент ТЕТ представляет собой альфа-кетоглутарат (α-KG) зависимую диоксигеназу, которая катализирует реакцию окисления путем включения одного атома кислорода молекулярного кислорода (O 2) в свой субстрат, 5 -метилцитозин в ДНК (5mC), чтобы произвести продукт 5-гидроксиметилцитозин в ДНК. Это преобразование сочетается с окислением вспомогательного субстрата α-KG до сукцината и диоксида углерода (см. Рисунок).
Первый этап включает связывание α-KG и 5-метилцитозина с активным сайтом фермента ТЕТ. Каждый из ферментов TET имеет основной каталитический домен с двухцепочечной β-спиральной складкой, которая содержит важные металлсвязывающие остатки, обнаруженные в семействе Fe (II) / α-KG-зависимых оксигеназ. α-KG координируется как бидентатный лиганд (связанный в двух точках) с Fe (II) (см. рисунок), в то время как 5mC удерживается нековалентной силой В непосредственной близости. Активный сайт TET содержит высококонсервативный мотив триады, в котором каталитически важный Fe (II) удерживается двумя остатками гистидина и одним остатком аспарагиновой кислоты (см. Рисунок). Триада связывается с одной стороной центра Fe, оставляя три лабильных сайта, доступных для связывания α-KG и O 2 (см. Рисунок). Затем TET превращает 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин, в то время как α-кетоглутарат превращается в сукцинат и CO 2.
Белки TET также обладают активностями, которые не зависят от деметилирования ДНК. К ним относятся, например, взаимодействие TET2 с O-связанной N-ацетилглюкозамин (O-GlcNAc ) трансферазой для стимулирования ацилирования гистона O-GlcN для воздействия на транскрипцию генов-мишеней.
Уровни метилирования во время раннего эмбрионального развития мыши. Геном сперматозоидов мыши на 80–90% метилирован его CpG-сайты в ДНК, составляющие около 20 миллионов метилированных сайтов. После оплодотворения, в начале первого дня эмбриогенеза, отцовские хромосомы почти полностью деметилируются за шесть часов в результате активного TET-зависимого процесса, до репликации ДНК начинается (синяя линия на рисунке).
Деметилирование материнского генома происходит посредством другого процесса. В зрелом ооците около 40% его CpG-сайтов в ДНК метилированы. В преимплантационном эмбрионе до стадии бластоцисты (см. Рисунок) единственная присутствующая метилтрансфераза - это изоформа DNMT1, обозначенная как DNMT1o. Похоже, что деметилирование материнских хромосом в основном происходит за счет блокирования метилирующего фермента DNMT1o от проникновения в ядро, за исключением кратковременной стадии 8-ми клеток (см. деметилирование ДНК ). ДНК материнского происхождения, таким образом, подвергается пассивному деметилированию за счет разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). морула (на стадии 16 клеток) имеет лишь небольшое количество метилирования ДНК (черная линия на рисунке).
Новообразованные примордиальные половые клетки (PGC) в имплантированном эмбрионе переходят из соматических клеток примерно на 7-й день эмбриогенеза у мыши. На данный момент PGC имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют от эпибласта к гребню гонад. Как рассмотрено Messerschmidt et al., Большинство PGCs арестовываются в фазе G2 клеточного цикла, в то время как они мигрируют к задней кишке в течение 7,5-8,5 дней эмбриона. Затем деметилирование PGC происходит в две волны. Существует как пассивное, так и активное TET-зависимое деметилирование примордиальных половых клеток. На 9.5 день первичные зародышевые клетки начинают быстро реплицироваться от примерно 200 PGC на 9,5 день эмбриона до примерно 10 000 PGC на 12,5 день. В течение 9,5–12,5 дней DNMT3a и DNMT3b репрессируются, а DNMT1 присутствует в ядре на высоком уровне. Но DNMT1 не может метилировать цитозины в течение 9,5–12,5 дней, потому что ген UHRF1 (также известный как NP95) репрессирован, а UHRF1 является важным белком, необходимым для рекрутирования DNMT1 в очаги репликации, где происходит поддерживающее метилирование ДНК. Это пассивная форма деметилирования с разбавлением.
Кроме того, с 9,5 по 13,5 дня зародыша наблюдается активная форма деметилирования. Как показано на рисунке пути деметилирования выше, два фермента являются центральными для активного деметилирования. Это метилцитозиндиоксигеназа с транслокацией десять-одиннадцать (TET) и тимин-ДНК-гликозилаза (TDG). Один конкретный фермент TET, TET1 и TDG, присутствуют на высоких уровнях с 9,5 до 13,5 дня эмбриона и используются в активном TET-зависимом деметилировании во время гаметогенеза. Геномы PGC обнаруживают самые низкие уровни метилирования ДНК среди любых клеток за весь жизненный цикл мыши к 13,5-му дню эмбриона.
Области мозга, участвующие в формировании памяти Обучение и память имеют уровни постоянства, отличные от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые временны по своей природе. Обучение и память могут накапливаться медленно (таблица умножения) или быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды их можно использовать для сознательного использования на долгое время. Крысы, подвергшиеся одному из случаев обусловливания контекстуальным страхом, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 часа после тренировки было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крысы дифференциально метилированы. Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после тренировки, причем более 500 генов были деметилированы. Результаты, аналогичные результатам, полученным в гиппокампе крыс, были также получены у мышей с контекстуальной обусловленностью страха.
Область гиппокампа мозга - это то место, где сначала сохраняются контекстные воспоминания о страхе (см. Рисунок), но эта память временна и сохраняется. не оставаться в гиппокампе. У крыс условное кондиционирование страха отменяется, когда гиппокамп подвергается гиппокампэктомии всего через день после кондиционирования, но крысы сохраняют значительную долю контекстного страха, когда гиппокампэктомия откладывается на четыре недели. У мышей, обследованных через 4 недели после кондиционирования, метилирование и деметилирование гиппокампа были обратными (гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся), в то время как существенное дифференциальное метилирование и деметилирование CpG происходило в корковых нейронах во время обслуживание памяти. Через четыре недели после контекстуального кондиционирования страха в передней поясной коре (см. Рисунок) мышей было 1223 дифференциально метилированных гена. Таким образом, в то время как в гиппокампе было много метилирований вскоре после формирования памяти, все эти метилирования гиппокампа были деметилированы уже через четыре недели.
Ли и др. сообщили об одном примере взаимосвязи между экспрессией белка TET, деметилированием и памятью при использовании тренировки экстинкции. Тренировка вымирания - это исчезновение ранее усвоенного поведения, когда оно не подкрепляется.
Сравнение между образцами нейронов инфралимбической префронтальной коры (ILPFC), полученными от мышей, обученных бояться слухового сигнала, и мышей, обученных вымиранию, выявило существенные, зависящие от опыта, геномные различия в накоплении 5-hmC в ILPFC. в ответ на обучение. Тренировка вымирания привела к значительному увеличению уровней РНК-мессенджера TET3 в корковых нейронах. TET3 избирательно активируется в неокортексе взрослого в зависимости от опыта.
A короткая шпилечная РНК (кшРНК) представляет собой искусственную молекулу РНК с плотным поворотом шпильки, которую можно использовать для подавления экспрессии целевого гена посредством РНК-интерференции. Мыши, обученные в присутствии кшРНК, нацеленной на ТЕТ3, показали значительное нарушение памяти на угасание страха.
. Структуры мозга, связанные с зависимостью прилежащее ядро (NAc) играет важную роль в зависимости. В прилежащем ядре мышей повторное воздействие кокаина приводило к снижению ТЕТ1 матричной РНК (мРНК) и снижению экспрессии белка ТЕТ1. Аналогичным образом, было ~ 40% снижение мРНК TET1 в NAc людей, страдающих от кокаиновой зависимости, исследованных посмертно.
Как указано выше в обучении и памяти, короткая шпилька РНК (shRNA) является искусственная молекула РНК с крутым поворотом шпильки, которую можно использовать для подавления экспрессии целевого гена посредством интерференции РНК. Feng et al. инъецированная shРНК, направленная на TET1 в NAc мышей. Это могло снизить экспрессию TET1 таким же образом, как и снижение экспрессии TET1 при воздействии кокаина. Затем они использовали косвенную меру зависимости, обусловленное предпочтение места. Обусловленное предпочтение места может измерять количество времени, которое животное проводит в зоне, связанной с воздействием кокаина, и это может указывать на пристрастие к кокаину. Снижение экспрессии Tet1, вызванное shRNA, введенной в NAc, значительно усилило кондиционирование места кокаином.
Как описано в статье Ноцицепция, ноцицепция - это реакция сенсорной нервной системы на вредные стимулы, такие как токсичные химикат, нанесенный на ткань. При ноцицепции химическая стимуляция сенсорных нервных клеток, называемых ноцицепторами, дает сигнал, который проходит по цепи нервных волокон через спинной мозг в мозг. Ноцицепция вызывает множество физиологических и поведенческих реакций и обычно приводит к субъективному переживанию или восприятию боли.
Работа Pan et al. впервые показали, что белки TET1 и TET3 в норме присутствуют в спинном мозге мышей. Они использовали вызывающую боль модель интра подошвенной инъекции 5% формалина в дорсальную поверхность задней лапы мыши и измерили время лизания задней лапы в качестве меры вызванной боли. Экспрессия белков TET1 и TET3 увеличилась на 152% и 160%, соответственно, через 2 часа после инъекции формалина. Принудительное снижение экспрессии TET1 или TET3 посредством спинномозговой инъекции Tet1-siRNA или Tet3-siRNA в течение трех дней подряд перед инъекцией формалина облегчало восприятие боли мышами. С другой стороны, принудительная сверхэкспрессия TET1 или TET3 в течение 2 дней подряд значительно вызвала болеутоляющее поведение, о чем свидетельствует снижение у мышей порога термической боли.
Кроме того, они показали, что эффекты ноцицептивной боли происходили посредством TET-опосредованного превращения 5-метилцитозина в гидроксиметилцитозин в промоторе микроРНК, обозначенной miR-365-3p, таким образом увеличивая ее экспрессию. Эта микроРНК, в свою очередь, обычно нацелена (снижает экспрессию) информационной РНК из Kcndiv class="ht", которая кодирует белок, известный как K v 11.1 или KCNH2. KCNH2 представляет собой альфа субъединицу ионного канала калия в центральной нервной системе. Вынужденное снижение экспрессии TET1 или TET3 посредством предварительной инъекции миРНК обращало вспять уменьшение белка KCNH2 у мышей, обработанных формалином.
