Войти
Трансфекция - это процесс преднамеренного введения голого или очищенного нуклеинового кислоты в эукариотические клетки. Он также может относиться к другим методам и типам клеток, хотя часто предпочтительны другие термины: «трансформация » обычно используется для описания невирусного переноса ДНК в бактерии и неживотные эукариотические клетки, включая клетки растений. В клетках животных трансфекция является предпочтительным термином, поскольку трансформация также используется для обозначения прогрессирования в злокачественное состояние (канцерогенез ) в этих клетках. Трансдукция часто используется для описания опосредованного вирусом переноса гена в эукариотические клетки.
Слово «трансфекция» - это портманто транс- и инфекции. генетический материал (такой как суперспиральная плазмидная ДНК или миРНК конструкции) или даже белки, такие как антитела, могут быть трансфицированы.
Трансфекция клеток животных обычно включает открытие временных пор или «дыр» в клеточной мембране, чтобы обеспечить поглощение материала. Трансфекцию можно проводить с использованием фосфата кальция (т.е. трикальцийфосфата ), электропорацией, сдавливанием клеток или смешиванием катионного липид с материалом для производства липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и откладывают свой груз внутри.
Трансфекция может привести к неожиданной морфологии и аномалиям в клетках-мишенях.
Значение этого термина изменилось. Первоначальное значение трансфекции было «инфицирование путем трансформации», то есть введение генетического материала, ДНК или РНК, из прокариотного -инфицирующего вируса или бактериофага в клетки, что приводит к инфекции.. Поскольку термин трансформация имеет другое значение в биологии клеток животных (генетическое изменение, позволяющее долгосрочное размножение в культуре или приобретение свойств, типичных для раковых клеток), термин трансфекция приобрел для животных клеток свое нынешнее значение изменения в клетке. свойства, вызванные введением ДНК.
Существуют различные методы введения чужеродной ДНК в эукариотическую клетку : некоторые полагаются на физическое лечение (электропорация, сжатие клеток, наночастицы, магнитофекция); другие полагаются на химические материалы или биологические частицы (вирусы), которые используются в качестве носителей. Доставка гена является, например, одним из этапов, необходимых для генной терапии и генетической модификации сельскохозяйственных культур. Существует множество различных методов доставки генов, разработанных для различных типов клеток и тканей, от бактерий до млекопитающих. Как правило, методы можно разделить на две категории: невирусные и вирусные.
Невирусные методы включают физические методы, такие как электропорация, микроинъекция, генная пушка, проникновение, гидростатическое давление, непрерывная инфузия, обработка ультразвуком и химические вещества, такие как липофекция, которая представляет собой липид-опосредованную ДНК- процесс трансфекции с использованием липосомных векторов. Он также может включать использование полимерных носителей генов (полиплексов).
Вирус доставка гена использует способность вируса вводить свою ДНК внутрь клетки-хозяина. Ген, который предназначен для доставки, упакован в вирусную частицу с дефицитом репликации. Вирусы, используемые на сегодняшний день, включают ретровирус, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус и вирус простого герпеса.. Однако есть недостатки в использовании вирусов для доставки генов в клетки. Вирусы могут доставлять в клетки только очень маленькие фрагменты ДНК, это трудоемко и сопряжено с риском случайных сайтов вставки цитопатических эффектов и мутагенеза.
Бактериальные сферопласты могут трансфицировать клетки животных.
Химическая трансфекция можно разделить на несколько видов: циклодекстрин, полимеры, липосомы или наночастицы ( с химической или вирусной функционализацией или без нее (см. ниже).
Электропоратор с прямоугольными волнами и формами экспоненциального затухания для in vitro, in vivo, прикрепленных клеток и 96 хорошо аппликации электропорации. Изготовлено BTX Harvard Apparatus, Холлистон Массачусетс, США. Другие методы трансфекции включают нуклеофекцию, которая доказала свою эффективность. эффективен при трансфекции клеточной линии THP-1, создавая жизнеспособную клеточную линию, которая способна дифференцироваться в зрелые макрофаги, и тепловой шок.
ДНК также могут быть введены в клетки с использованием вирусов в качестве носителя. В таких случаях метод называется трансдукцией, и клетки называют трансдуцированными. Аденовирусные векторы могут быть полезны для способов вирусной трансфекции, поскольку они могут переносить гены в самые разные клетки человека и имеют высокие скорости переноса. Лентивирусные векторы также полезны из-за их способности трансдуктировать клетки, в настоящее время не подвергающиеся митозу.
Стабильная и временная трансфекция различаются по своему долгосрочному воздействию на клетку; стабильно трансфицированная клетка будет непрерывно экспрессировать трансфицированную ДНК и передавать ее дочерним клеткам, в то время как временно трансфицированная клетка будет экспрессировать трансфицированную ДНК в течение короткого промежутка времени и не будет передавать ее дочерним клеткам.
Для некоторых применений трансфекции достаточно, если трансфицированный генетический материал экспрессируется только временно. Поскольку ДНК, введенная в процессе трансфекции, обычно не интегрируется в ядерный геном, чужеродная ДНК будет разбавляться посредством митоза или деградировать. Клеточные линии, экспрессирующие ядерный антиген 1 (EBNA1) вируса Эпштейна-Барра (EBV) или большой Т-антиген SV40, позволяют эписомную амплификацию плазмид, содержащих вирусные начала EBV (293E) или SV40 (293T) репликация, значительно снижающая скорость разведения.
Если желательно, чтобы трансфицированный ген действительно оставался в геноме клетки и ее дочерних клетках, должна происходить стабильная трансфекция. Для этого ген-маркер котрансфицируется, что дает клетке некоторое селективное преимущество, такое как устойчивость к определенному токсину. Некоторые (очень немногие) трансфицированные клетки случайно интегрировали чужеродный генетический материал в свой геном. Если токсин затем добавить в культуру клеток, только те несколько клеток, в геном которых интегрирован маркерный ген, смогут пролиферировать, в то время как другие клетки погибнут. После применения этого селективного стресса (давления отбора) в течение некоторого времени остаются только клетки со стабильной трансфекцией, и их можно культивировать дальше.
Обычными агентами для выбора стабильной трансфекции являются:
РНК также может быть трансфицированы в клетки для временной экспрессии кодируемого им белка или для изучения кинетики распада РНК. Трансфекция РНК часто используется в первичных клетках, которые не делятся.
миРНК также можно трансфицировать для достижения молчания РНК (т. Е. Потери РНК и белка из гена-мишени). Это стало основным приложением в исследованиях для достижения «нокдауна » интересующих белков (например, эндотелина-1) с потенциальным применением в генной терапии. Ограничением подхода молчания являются токсичность трансфекции для клеток и потенциальные «нецелевые» эффекты на экспрессию других генов / белков.
