Войти
Вирусные векторы - это инструменты, обычно используемые молекулярными биологами для доставки генетического материала в клетки. Этот процесс можно проводить внутри живого организма (in vivo ) или в культуре клеток (in vitro ). Вирусы развили специализированные молекулярные механизмы для эффективной транспортировки своих геномов внутри клеток, которые они заражают. Доставка генов или другого генетического материала вектором называется трансдукцией, а инфицированные клетки описываются как трансдуцированные. Молекулярные биологи впервые использовали этот механизм в 1970-х годах. Пол Берг использовал модифицированный вирус SV40, содержащий ДНК от бактериофага λ, для заражения клеток почек обезьян, поддерживаемых в культуре.
Помимо использования в исследованиях молекулярной биологии, вирусные векторы используются для генной терапии и разработки вакцин.
Вирусные векторы адаптированы к их конкретным приложениям, но обычно имеют несколько общих свойств.
Вирусные векторы были первоначально разработаны как альтернатива трансфекции голой ДНК для молекулярно-генетических экспериментов. По сравнению с традиционными методами, такими как преципитация фосфатом кальция , трансдукция может гарантировать, что почти 100% клеток инфицированы, без серьезного воздействия на жизнеспособность клеток. Кроме того, некоторые вирусы интегрируют в клеточный геном, способствуя стабильной экспрессии.
Гены, кодирующие белок, могут быть экспрессированы с использованием вирусных векторов, обычно для изучения функции конкретного белка. Вирусные векторы, особенно ретровирусы, стабильно экспрессирующие маркерные гены, такие как GFP, широко используются для постоянного маркирования клеток для отслеживания их и их потомства, например, в экспериментах по ксенотрансплантации, когда клетки, инфицированные in vitro, имплантируют животному-хозяину.
Встраивание гена дешевле выполнять, чем нокаут гена. Но поскольку молчание иногда неспецифично и оказывает нецелевое воздействие на другие гены, оно дает менее надежные результаты. Векторы животных-хозяев также играют важную роль.
Генная терапия - это метод исправления дефектных генов, ответственных за развитие болезни. В будущем генная терапия может предоставить способ лечения генетических нарушений, таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит, кистозный фиброз или даже гемофилия A. Поскольку эти заболевания являются результатом мутаций в последовательности ДНК для конкретных генов, в исследованиях генной терапии использовали вирусы для доставки немутантных копий этих генов в клетки тела пациента. Генная терапия добилась огромных успехов в лабораторных условиях. Однако необходимо преодолеть несколько проблем вирусной генной терапии, прежде чем она получит широкое распространение. Иммунный ответ на вирусы не только препятствует доставке генов к клеткам-мишеням, но может вызывать серьезные осложнения для пациента. В одном из первых испытаний генной терапии в 1999 г. это привело к смерти Джесси Гелсингера, который лечился с использованием аденовирусного вектора.
Некоторые вирусные векторы, например гамма- ретровирусы, вставляют свои геномы в кажущееся случайным место на одной из хромосом хозяина, что может нарушить функцию клеточных генов и привести к раку. В исследовании тяжелого комбинированного иммунодефицита ретровирусной генной терапии, проведенного в 2002 году, у четырех пациентов в результате лечения развился лейкоз; трое из пациентов выздоровели после химиотерапии. Векторы на основе аденоассоциированного вируса намного безопаснее в этом отношении, поскольку они всегда интегрируются в одном и том же месте в геноме человека и применяются при различных заболеваниях, таких как Болезнь Альцгеймера.
A живая векторная вакцина представляет собой вакцину, в которой используется химически ослабленный вирус для транспортировки частей патогена с целью стимулирования иммунный ответ. Вирусы, экспрессирующие белки патогенов, в настоящее время разрабатываются в качестве вакцин против этих патогенов, исходя из тех же соображений, что и ДНК-вакцины. Гены, используемые в таких вакцинах, обычно кодируются антигеном из патогенного организма. Затем они вставляются в геном непатогенного организма, где они экспрессируются на поверхности организма и могут вызывать иммунный ответ.
Примером может служить вакцина против гепатита B, где инфекция гепатита B контролируется с помощью рекомбинантной вакцины, которая содержит поверхностную форму вируса гепатита B. антиген, продуцируемый дрожжевыми клетками. Разработка рекомбинантной субъединичной вакцины была важной и необходимой разработкой, поскольку вирус гепатита В, в отличие от других распространенных вирусов, таких как вирус полиомиелита, не может выращиваться in vitro.
Т-лимфоцитами распознавать клетки, инфицированные внутриклеточными паразитами, на основе чужеродных белков, продуцируемых внутри клетки. Т-клеточный иммунитет имеет решающее значение для защиты от вирусных инфекций и таких заболеваний, как малярия. Вирусная вакцина индуцирует экспрессию патогенных белков в клетках-хозяевах аналогично вакцине Sabin полиомиелиту и другим аттенуированным вакцинам. Однако, поскольку вирусные вакцины содержат лишь небольшую часть генов патогенов, они намного безопаснее, и спорадическое заражение патогеном невозможно. Аденовирусы активно разрабатываются в качестве вакцин.
Ретровирусы являются одной из опор современных подходов к генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молони , обладают способностью стабильно интегрироваться в геном хозяина. Они содержат обратную транскриптазу для создания ДНК-копии генома РНК и интегразу, которая обеспечивает интеграцию в геном хозяина . Они использовались в ряде одобренных FDA клинических испытаний, таких как испытание SCID-X1.
Ретровирусные векторы могут быть репликационно-компетентными или репликационно-дефектными. Векторы с дефектом репликации являются наиболее распространенным выбором в исследованиях, потому что у вирусов кодирующие области для генов, необходимых для дополнительных раундов репликации и упаковки вириона, заменены другими генами или удалены. Эти вирусы способны инфицировать свои клетки-мишени и доставлять свою вирусную нагрузку, но затем не могут продолжать типичный литический путь, который приводит к лизису и гибели клеток.
И наоборот, репликационно-компетентные вирусные векторы содержат все необходимые гены для синтеза вирионов и продолжают размножаться после заражения. Поскольку вирусный геном для этих векторов намного длиннее, длина фактически вставленного интересующего гена ограничена по сравнению с возможной длиной вставки для векторов с дефектом репликации. В зависимости от вирусного вектора типичная максимальная длина допустимой вставки ДНК в вирусном векторе с дефектом репликации обычно составляет около 8-10 килобайт. Хотя это ограничивает введение многих геномных последовательностей, большинство последовательностей кДНК все же можно приспособить.
Главный недостаток использования ретровирусов, таких как ретровирус Молони, заключается в том, что клетки должны активно делиться для трансдукции. В результате клетки, такие как нейроны, очень устойчивы к инфекции и трансдукции ретровирусами.
Есть опасения, что инсерционный мутагенез вследствие интеграции в геном хозяина может привести к раку или лейкемии. Эта проблема оставалась теоретической до тех пор, пока генная терапия десяти SCID-X1 пациентов с использованием вируса мышиного лейкоза Мэлони не привела к двум случаям лейкемии, вызванной активацией LMO2 <88.>онкоген из-за соседней интеграции вектора.
Упаковка и трансдукция лентивирусным вектором. Лентивирусы являются подклассом ретровирусов. Иногда они используются в качестве векторов для генной терапии благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, что является уникальной особенностью лентивирусов, поскольку другие ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки. клетки. Вирусный геном в форме РНК подвергается обратной транскрипции, когда вирус проникает в клетку для производства ДНК, которая затем случайным образом вставляется в геном. положение (недавние открытия фактически предполагают, что внедрение вирусной ДНК не является случайным, а направлено на конкретные активные гены и связано с организацией генома) вирусным ферментом интеграза . Вектор, теперь называемый провирусом, остается в геноме и передается потомству клетки при делении. Пока не существует методов определения места интеграции, которые могут создать проблему. провирус может нарушать функцию клеточных генов и приводить к активации онкогенов, способствующих развитию рака, что вызывает опасения по поводу возможных применение лентивирусов в генной терапии. Однако исследования показали, что лентивирусные векторы имеют меньшую тенденцию к интеграции в местах, потенциально вызывающих рак, чем гамма-ретровирусные векторы. В частности, одно исследование показало, что лентивирусные векторы не вызывали ни увеличения заболеваемости опухолями, ни более раннего возникновения опухолей у линии мышей с гораздо более высокой заболеваемостью опухолями. Более того, клинические испытания, в которых использовались лентивирусные векторы для доставки генной терапии для лечения ВИЧ, не показали увеличения мутагенных или онкологических явлений.
По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут гены, необходимые для их репликации. Для получения лентивируса несколько плазмид трансфицируют в так называемую упаковку клеточной линии, обычно HEK 293. Одна или несколько плазмид, обычно называемых упаковывающими плазмидами, кодируют белки вириона , такие как капсид и обратная транскриптаза. Другая плазмида содержит генетический материал, который должен доставить вектор. Он транскрибируется для получения вирусного генома с одноцепочечной РНК и маркируется наличием последовательности ψ (psi). Эта последовательность используется для упаковки генома в вирион.
В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется во время деления клеток. Это ограничивает их использование в фундаментальных исследованиях, хотя аденовирусные векторы все еще используются в экспериментах in vitro, а также in vivo. Их основные применения - генная терапия и вакцинация. Поскольку люди обычно контактируют с аденовирусами, которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, у большинства пациентов уже выработаны нейтрализующие антитела, которые могут инактивировать вирус до того, как он достигнет клетки-мишени.. Чтобы преодолеть эту проблему, ученые в настоящее время исследуют аденовирусы, которые инфицируют различные виды, к которым у людей нет иммунитета.
Аденоассоциированный вирус (AAV) - небольшой вирус, поражающий людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время не известно, что AAV вызывает заболевание и вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и может включать свой геном в геном клетки-хозяина. Более того, AAV в основном остается эписомным (реплицируется без включения в хромосому); выполняя долгое и стабильное выражение. Эти особенности делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии. Однако AAV может передавать только до 5 КБ, что значительно меньше исходной емкости AAV.
Кроме того, из-за его потенциального использования в качестве вектора генной терапии исследователи создали измененный AAV, названный само- комплементарный аденоассоциированный вирус (scAAV). В то время как AAV упаковывает одну цепь ДНК и требует процесса синтеза второй цепи, scAAV упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе с образованием двухцепочечной ДНК. Пропуск синтеза второй цепи scAAV обеспечивает быструю экспрессию в клетке. В остальном scAAV обладает многими характеристиками своего аналога AAV.
Вирусы растений могут использоваться для создания вирусных векторов, инструментов, обычно используемых для доставки генетического материала в клетки растений ; они также являются источниками биоматериалов и нанотехнологических устройств. Вирус табачной мозаики (TMV) - первый обнаруженный вирус. Вирусные векторы на основе вируса табачной мозаики включают векторы, используемые в технологиях экспрессии растений magnICON® и TRBO.
Гибридные векторы - это векторные вирусы, которые генетически сконструированы и обладают качествами более чем одного вектора. Вирусы изменяют, чтобы избежать недостатков типичных вирусных векторов, которые могут иметь ограниченную нагрузочную способность, иммуногенность, генотоксичность и не могут поддерживать долгосрочную адекватную трансгенную экспрессию. За счет замены нежелательных элементов желаемыми способностями гибридные векторы могут в будущем превзойти стандартные векторы трансфекции с точки зрения безопасности и терапевтической эффективности.
Выбор вирусный вектор для доставки генетического материала в клетки сопряжен с некоторыми логистическими проблемами. Существует ограниченное количество вирусных векторов, доступных для терапевтического использования. Любой из этих нескольких вирусных векторов может вызвать в организме развитие иммунного ответа, если вектор рассматривается как чужеродный захватчик. После использования вирусный вектор не может быть эффективно использован снова у пациента, потому что он будет распознаваться организмом. Если вакцина или генная терапия потерпят неудачу в клинических испытаниях, вирус не может быть снова использован у пациента для другой вакцины или генной терапии в будущем.. Ранее существовавший иммунитет против вирусного вектора также может присутствовать у пациента, что делает терапию неэффективной для этого пациента. Можно противодействовать ранее существовавшему иммунитету при использовании вирусного вектора для вакцинации путем примирования невирусной ДНК-вакциной, но этот метод требует дополнительных затрат. и препятствие в процессе распределения вакцины. Существующий ранее иммунитет также может быть вызван увеличением дозы вакцины или изменением способа вакцинации. Некоторые недостатки вирусных векторов (такие как генотоксичность и низкая трансгенная экспрессия) можно преодолеть с помощью гибридных векторов.
