Войти
Грамотрицательные бактерии, пытающиеся расти и делиться в присутствии антибиотиков, подавляющих синтез пептидогликана (например, пенициллина), не могут этого сделать и вместо этого образуют сферопласты. A сферопласт (или сферопласт в британском использовании) - это микробная клетка, из которой клеточная стенка почти полностью удалена, например, под действием пенициллина или лизоцим. Согласно некоторым определениям, этот термин используется для обозначения грамотрицательных бактерий. Согласно другим определениям, этот термин также включает дрожжи. Название сферопласт происходит от того факта, что после переваривания клеточной стенки микроба напряжение мембраны заставляет клетку приобретать характерную сферическую форму. Сферопласты осмотически хрупкие и будут лизировать при переносе в гипотонический раствор.
При использовании для описания грамотрицательных бактерий термин сферопласт относится к клеткам, из которых компонент пептидогликан, но не компонент внешней мембраны клеточной стенки был удален.
Различные антибиотики превращают грамотрицательные бактерии в сферопласты. К ним относятся ингибиторы синтеза пептидогликана, такие как фосфомицин, ванкомицин, моеномицин, лактивицин и β-лактамные антибиотики. Антибиотики, которые ингибируют биохимические пути непосредственно перед синтезом пептидогликана, также индуцируют сферопласты (например, фосмидомицин, фосфоенолпируват ).
В дополнение к вышеуказанным антибиотикам ингибиторы синтеза белка (например,. хлорамфеникол, окситетрациклин, несколько аминогликозидов ) и ингибиторы синтеза фолиевой кислоты (например, триметоприм, сульфаметоксазол ) также вызывают образование сферопластов грамотрицательными бактериями.
Фермент лизоцим заставляет грамотрицательные бактерии формировать сферопласты, но только если мембрана пермеабилизатор, такой как лактоферрин или этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), используется для облегчения прохождения фермента через внешнюю мембрану. ЭДТА действует как пермеабилизатор, связываясь с двухвалентными ионами, такими как в виде Са и удаления их с внешней мембраны.
Дрожжи Candida albicans можно превратить в сферопласты с помощью ферментов литиказа, хитиназа и β-глюкуронидаза.
С 1960-х по 1990-е гг. Merck and Co. использовали скрининг сферопластов в качестве основного метода открытия антибиотиков, которые ингибируют биосинтез клеточной стенки. На этом экране, разработанном Юджином Дулани, растущие бактерии подвергались воздействию тестируемых веществ в гипертонических условиях. Ингибиторы синтеза клеточной стенки заставляли растущие бактерии формировать сферопласты. Этот экран позволил обнаружить фосфомицин, цефамицин C, тиенамицин и несколько карбапенемов.
Сферопласт E.coli, заделанный стеклянной пипеткой. 139>Специально подготовленные гигантские сферопласты грамотрицательных бактерий можно использовать для изучения функции бактериальных ионных каналов с помощью метода, называемого патч-зажим, который изначально был разработан для характеристики поведения нейронов и других возбудимых клеток. Для получения гигантских сферопластов бактерии обрабатывают ингибитором септации (например, цефалексином ). Это заставляет бактерии образовывать филаменты, удлиненные клетки, у которых отсутствуют внутренние поперечные стенки. Через некоторое время клеточные стенки нитей перевариваются, и бактерии разрушаются в очень большие сферы, окруженные только их цитоплазматическими и внешними мембранами. Затем мембраны могут быть проанализированы на аппарате patch clamp для определения фенотипа ионных каналов, встроенных в него. Также часто сверхэкспрессирует конкретный канал, чтобы усилить его эффект и упростить определение характеристик.
Техника зажима заплат великана Э. coli были использованы для изучения нативных механочувствительных каналов (MscL, MscS и MscM) E. coli. Он был расширен для изучения других гетерологически экспрессируемых ионных каналов, и было показано, что гигантский сферопласт E. coli может использоваться в качестве системы экспрессии ионных каналов, сравнимой с Xenopus ооцит.
Дрожжевые клетки обычно защищены толстой клеточной стенкой, что затрудняет экстракцию клеточных белков. Ферментативное переваривание клеточной стенки зимолиазой с образованием сферопластов делает клетки уязвимыми для легкого лизиса с помощью детергентов или быстрых изменений осмолярного давления.
Бактериальные сферопласты с вставленная в них подходящая рекомбинантная ДНК может использоваться для трансфекции клеток животных. Сферопласты с рекомбинантной ДНК вводятся в среду, содержащую клетки животных, и сливаются с полиэтиленгликолем (PEG). С помощью этого метода почти 100% клеток животных могут поглощать чужеродную ДНК. После проведения экспериментов по модифицированному протоколу Hanahan с использованием хлорида кальция в E. coli было определено, что сферопласты могут трансформироваться при 4,9x10.
