Войти
Воспроизвести медиа Видео высокочастотной необратимой электропорации (H- FIRE) для нетепловой абляции без мышц Электропорация или электропроницаемость - это метод микробиологии, в котором электрическое поле применяется к клеткам для увеличения проницаемости клеточной мембраны, позволяя вводить химические вещества, лекарства или ДНК в клетку (также называемый электропереносом ). В микробиологии процесс электропорации часто используется для трансформации бактерий, дрожжей или растений протопластов с помощью введение новой кодирующей ДНК. Если бактерии и плазмиды смешиваются вместе, плазмиды могут быть перенесены в бактерии после электропорации, хотя в зависимости от того, что переносится проникающие в клетки пептиды или CellSqueeze также может быть использован. Электропорация работает путем пропускания тысяч вольт через подвешенные клетки на расстояние от одного до двух миллиметров в кювете для электропорации (1,0–1,5 кВ, 250–750 В / см). После этого с клетками нужно обращаться осторожно, пока они не разделятся, давая новые клетки, содержащие воспроизводимые плазмиды. Этот процесс примерно в десять раз более эффективен, чем химическая трансформация.
Электропорация также очень эффективна для введения чужеродных генов в клетки культуры ткани, особенно в клетки млекопитающих. Например, его используют в процессе получения мышей с нокаутом, а также в лечении опухолей, генной терапии и клеточной терапии. Процесс введения чужеродной ДНК в эукариотические клетки известен как трансфекция. Электропорация очень эффективна для трансфекции клеток в суспензии с использованием кювет для электропорации. Электропорация доказала свою эффективность для использования на тканях in vivo, для внутриутробных применений, а также для трансфекции in ovo. Прилипшие клетки также можно трансфицировать с помощью электропорации, что дает исследователям альтернативу трипсинизации их клеток перед трансфекцией. Однако одним из недостатков электропорации является то, что после процесса может быть нарушена экспрессия более 7000 генов. Это может вызвать проблемы в исследованиях, в которых необходимо контролировать экспрессию генов, чтобы гарантировать точные результаты.
Хотя объемная электропорация имеет много преимуществ по сравнению с физическими методами доставки, такими как микроинъекции и генные пушки, она все же имеет ограничения, включая низкую жизнеспособность клеток. Миниатюризация электропорации была изучена, приводя к нанотрансфекции ткани с использованием методов, основанных на электропорации через наноканалы, для минимально инвазивной доставки груза к клеткам.
Электропорация также использовалась как механизм для запуска слияние клеток. Искусственно индуцированное слияние клеток можно использовать для исследования и лечения различных заболеваний, таких как диабет, регенерации аксонов центральной нервной системы и получения клеток с желаемыми свойствами, например, в клеточных вакцинах для иммунотерапии рака. Однако первым и наиболее известным применением слияния клеток является получение моноклональных антител в технологии гибридом, где линии гибридных клеток (гибридомы) образуются путем слияния продуцирующих специфические антитела В-лимфоцитов с линией клеток миеломы (рак В-лимфоцитов).
Кюветы для электропорации in-vitro. Это пластик с алюминиевыми электродами и синей крышкой. Они вмещают не более 400. μl.Электропорация выполняется с помощью электропораторов, специальных устройств, которые создают электростатическое поле в растворе клеток. Суспензию элемента пипетируют в стеклянную или пластиковую кювету, которая имеет два алюминиевых электрода по бокам. Для бактериальной электропорации обычно используется суспензия размером около 50 микролитров. Перед электропорацией эту суспензию бактерий смешивают с плазмидой, подлежащей трансформации. Смесь пипеткой помещается в кювету, устанавливаются напряжение и емкость, и кювета вставляется в электропоратор. Процесс требует прямого контакта между электродами и подвеской. Сразу после электропорации к бактериям добавляется один миллилитр жидкой среды (в кювете или в пробирке Эппендорфа ), и пробирка инкубируется при оптимальной температуре бактерий в течение часа или более, чтобы обеспечить восстановление бактерий. клетки и экспрессия плазмиды с последующей бактериальной культурой на чашках с агаром.
Успех электропорации во многом зависит от чистоты раствора плазмиды, особенно от содержания в нем соли. Растворы с высокой концентрацией соли могут вызвать электрический разряд (известный как искрение ), который часто снижает жизнеспособность бактерий. Для дальнейшего подробного исследования процесса больше внимания следует уделять выходному сопротивлению устройства поратора и входному сопротивлению суспензии клеток (например, salt содержание).
Поскольку клеточная мембрана не может пропускать ток (кроме ионных каналов), она действует как электрический конденсатор. Воздействие на мембраны электрического поля высокого напряжения приводит к их временному разрушению, в результате чего образуются поры, достаточно большие для того, чтобы макромолекулы (например, ДНК) могли проникать в клетку или выходить из нее.
Кроме того, электропорация может использоваться для увеличить проницаемость клеток при внутриутробных инъекциях и операциях. В частности, электропорация позволяет более эффективно трансфекцию ДНК, РНК, shRNA и всех нуклеиновых кислот в клетки мышей и крыс. Успех электропорации in vivo сильно зависит от напряжения, повторения, импульсов и продолжительности. Развивающиеся центральные нервные системы наиболее эффективны для электропорации in vivo благодаря видимости желудочков для инъекций нуклеиновых кислот, а также повышенной проницаемости делящихся клеток. Электропорация эмбрионов, введенных внутриутробно, осуществляется через стенку матки, часто с помощью электродов типа щипцов, чтобы ограничить повреждение эмбриона.
Впервые описан электроперенос гена in vivo в 1991 г. и сегодня проводится множество доклинических исследований электропереноса генов. Этот метод используется для доставки большого количества терапевтических генов для потенциального лечения нескольких заболеваний, таких как: нарушения иммунной системы, опухоли, метаболические нарушения, моногенетические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, анальгезия….
Что касается необратимых электропорация, первое успешное лечение злокачественных кожных опухолей, имплантированных мышам, было завершено в 2007 году группой ученых, которые добились полного удаления опухоли у 12 из 13 мышей. Они достигли этого, послав 80 импульсов по 100 микросекунд с частотой 0,3 Гц с величиной электрического поля 2500 В / см для лечения кожных опухолей. В настоящее время ряд компаний, в том числе AngioDynamics, Inc. и VoltMed, Inc., продолжают разрабатывать и внедрять технологии необратимой электропорации в клинических условиях.
Первую группу, изучавшую электропорацию в медицинских целях, возглавил Луис Мир из Института Гюстава Русси. В этом случае они рассмотрели использование обратимой электропорации в сочетании с непроницаемыми макромолекулами. Первое исследование, посвященное тому, как наносекундные импульсы могут быть использованы на человеческих клетках, было проведено исследователями из Медицинской школы Восточной Вирджинии и Университета Старого Доминиона и опубликовано в 2003 году.>Медицинское применение
Первое медицинское применение электропорации было использовано для введения плохо проникающих противоопухолевых препаратов в опухолевые узелки. Вскоре особый интерес приобрел и электроперенос гена из-за его невысокой стоимости, простоты реализации и безопасности. А именно, вирусные векторы могут иметь серьезные ограничения с точки зрения иммуногенности и патогенности при использовании для переноса ДНК.
Было обнаружено, что у свиней более высокое напряжение электропорации необратимо разрушает клетки-мишени в узком диапазоне оставляя соседние клетки нетронутыми, и, таким образом, представляет собой многообещающее новое лечение рака, болезней сердца и других болезненных состояний, требующих удаления ткани. Необратимая электропорация (IRE) с тех пор доказала свою эффективность в лечении рака человека: хирурги Johns Hopkins и другие учреждения теперь используют эту технологию для лечения рака поджелудочной железы, который ранее считался неоперабельным <46.>
Также сообщалось о первом клиническом испытании фазы I электропереноса гена у пациентов с метастатической меланомой. Осуществляли опосредованную электропорацией доставку плазмидного гена, кодирующего интерлейкин-12 (pIL-12), и контролировали безопасность, переносимость и терапевтический эффект. Исследование пришло к выводу, что электроперенос гена с помощью pIL-12 безопасен и хорошо переносится. Кроме того, частичный или полный ответ наблюдался также при удаленных нелеченных метастазах, что свидетельствует о системном эффекте лечения. На основании этих результатов они уже планируют перейти ко второй фазе клинических исследований. В настоящее время проводится несколько клинических исследований электропереноса генов, в ходе которых отслеживается безопасность, переносимость и эффективность иммунизации ДНК-вакциной, которую вводят с помощью электрических импульсов.
Хотя этот метод не является системным, а строго локальным, он все же является наиболее эффективной невирусной стратегией доставки генов.
Недавний метод, называемый нетепловой необратимой электропорацией (N-TIRE), оказался успешным при лечении многих различных типов опухолей и других нежелательных тканей. Эта процедура выполняется с использованием небольших электродов (диаметром около 1 мм), помещаемых либо внутри, либо вокруг целевой ткани, чтобы подавать короткие повторяющиеся электрические разряды с заданным напряжением и частотой. Эти всплески электричества увеличивают трансмембранный потенциал покоя (TMP), так что в плазматической мембране образуются нанопоры. Когда электричество, приложенное к ткани, превышает пороговое значение электрического поля целевой ткани, клетки становятся постоянно проницаемыми из-за образования нанопор. В результате клетки не могут восстановить повреждение и погибают из-за потери гомеостаза. N-TIRE уникален по сравнению с другими методами удаления опухоли тем, что не вызывает теплового повреждения окружающей ткани.
В отличие от этого, обратимая электропорация происходит, когда электричество, приложенное к электродам, ниже порогового значения электрического поля целевой ткани. Поскольку приложенное электричество ниже порога клеток, оно позволяет клеткам восстанавливать свой фосфолипидный бислой и продолжать свои нормальные клеточные функции. Обратимая электропорация обычно проводится с помощью лечения, которое включает введение лекарства или гена (или другой молекулы, которая обычно не проницаема для клеточной мембраны) в клетку. Не все ткани имеют одинаковый порог электрического поля; поэтому перед лечением необходимо провести тщательные расчеты, чтобы гарантировать безопасность и эффективность.
Одним из основных преимуществ использования N-TIRE является то, что при правильном выполнении в соответствии с тщательными расчетами он влияет только на ткань-мишень. Белки, внеклеточный матрикс и важные структуры, такие как кровеносные сосуды и нервы, не затрагиваются и остаются здоровыми при этом лечении. Это позволяет ускорить выздоровление и способствует более быстрой замене мертвых опухолевых клеток здоровыми.
Перед выполнением процедуры ученые должны тщательно рассчитать, что именно нужно делать, и лечить каждого пациента в индивидуальном случае. в индивидуальном порядке. Для этого обычно используются технологии визуализации, такие как компьютерная томография и МРТ, для создания трехмерного изображения опухоли. Основываясь на этой информации, они могут приблизительно оценить объем опухоли и выбрать лучший способ действий, включая место введения электродов, угол, под которым они вставлены, необходимое напряжение и многое другое, используя программные технологии. Часто компьютерная томография используется для установки электродов во время процедуры, особенно когда электроды используются для лечения опухолей головного мозга.
Вся процедура выполняется очень быстро, обычно занимает около пяти минут. Степень успеха этих процедур высока и многообещающе для будущего лечения людей. Одним из недостатков использования N-TIRE является то, что электричество, поступающее от электродов, может стимулировать сокращение мышечных клеток, что может иметь летальные последствия в зависимости от ситуации. Поэтому при проведении процедуры необходимо использовать паралитическое средство. Паралитические агенты, которые использовались в таких исследованиях, оказались успешными; однако всегда есть некоторый риск, хотя и небольшой, при использовании анестетиков.
Был разработан более поздний метод, названный высокочастотной необратимой электропорацией (H-FIRE). В этом методе используются электроды для подачи биполярных импульсов электричества с высокой частотой, в отличие от униполярных импульсов электричества с низкой частотой. Этот тип процедуры имеет такой же успех при удалении опухоли, что и N-TIRE. Однако у него есть одно явное преимущество: H-FIRE не вызывает мышечных сокращений у пациента, и поэтому нет необходимости в паралитическом средстве. Кроме того, было продемонстрировано, что H-FIRE производит более предсказуемые абляции из-за меньшей разницы в электрических свойствах тканей на более высоких частотах.
Электропорация также может использоваться для помогают доставлять лекарства или гены в клетку, применяя короткие и интенсивные электрические импульсы, которые временно проникают в клеточную мембрану, что позволяет транспортировать молекулы, которые иначе не переносились бы через клеточную мембрану. Эта процедура называется электрохимиотерапией, если транспортируемые молекулы являются химиотерапевтическими агентами, или электропереносом гена, когда транспортируемой молекулой является ДНК. Ученые из Каролинского института и Оксфордского университета используют электропорацию экзосом для доставки миРНК, антисмысловых олигонуклеотидов, химиотерапевтических агентов и белков в нейроны после их системного введения ( в крови). Поскольку эти экзосомы способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, этот протокол может решить проблему плохой доставки лекарств в центральную нервную систему и потенциально лечить болезнь Альцгеймера, Болезнь Паркинсона и рак мозга среди других состояний.
Бактериальная трансформация, как правило, является самым простым способом получения больших количеств определенного белка, необходимого для целей биотехнологии или медицины. Поскольку электроперенос гена является очень простым, быстрым и высокоэффективным методом, он сначала стал очень удобной заменой других процедур трансформации.
Схематическое поперечное сечение, показывающее теоретическое расположение липидов в гидрофобной поре (вверху) и гидрофильная пора (внизу). Электропорация позволяет вводить в клетки большие сильно заряженные молекулы, такие как ДНК, которые никогда не будут пассивно диффундировать через гидрофобное двухслойное ядро . Это явление указывает на то, что механизм заключается в создании в мембране заполненных водой отверстий в нанометровом масштабе. Электропоры были оптически отображены в моделях липидного бислоя, таких как бислои границы раздела капель и гигантские однослойные везикулы, в то время как добавление цитоскелетных белков, таких как актиновые сети, к гигантским однослойным пузырькам, по-видимому, предотвращает образование видимых электропор. Также появились экспериментальные доказательства того, что сети актина регулируют проницаемость клеточных мембран. Хотя электропорация и диэлектрический пробой являются результатом приложения электрического поля, задействованные механизмы принципиально различаются. При пробое диэлектрика материал барьера ионизируется, создавая проводящий путь. Таким образом, изменение материала носит химический характер. Напротив, во время электропорации молекулы липидов не изменяются химически, а просто меняют положение, открывая поры, которые действуют как проводящий путь через бислой, поскольку он заполнен водой.
Электропорация - это динамическое явление, которое зависит от местного трансмембранного напряжения в каждой точке клеточной мембраны. Принято считать, что для данной длительности и формы импульса существует определенный порог трансмембранного напряжения для проявления явления электропорации (от 0,5 В до 1 В). Это приводит к определению порога величины электрического поля для электропорации (E th). То есть, электропорации подвергаются только клетки в областях, где E ≧ E th. Если второй порог (E ir) достигнут или превзойден, электропорация поставит под угрозу жизнеспособность клеток, то есть необратимую электропорацию (IRE).
Электропорация - это многоэтапный процесс с несколько отдельных фаз. Сначала необходимо подать короткий электрический импульс. Типичные параметры для < 1 ms across the membrane (note- the voltages used in cell experiments are typically much larger because they are being applied across large distances to the bulk solution so the resulting field across the actual membrane is only a small fraction of the applied bias). Upon application of this potential the membrane charges like a конденсатора составляют 300–400 мВ за счет миграции ионов из окружающего раствора. Как только критическое поле достигнуто, в морфологии липидов происходит быстрая локальная перестройка. Полагают, что полученная структура представляет собой «предварительную пору», поскольку она не является электрически проводящей, но быстро приводит к образованию проводящей поры. Свидетельством существования таких пре-пор является, в основном, «мерцание» пор, которое предполагает переход между проводящим и изолирующим состояниями. Было высказано предположение, что эти препоры представляют собой небольшие (~ 3 Å) гидрофобные дефекты. Если эта теория верна, то переход в проводящее состояние можно объяснить перестройкой на краю поры, при которой липидные головки складываются, создавая гидрофильный интерфейс. Наконец, эти проводящие поры могут либо заживать, закрывая бислой, либо расширяться, в конечном итоге разрывая его. Результат зависит от того, был ли превышен критический размер дефекта, который, в свою очередь, зависит от приложенного поля, локального механического напряжения и энергии края бислоя.
Приложение электрических импульсов достаточной силы к клетке вызывает увеличение трансмембранной разности потенциалов, что вызывает дестабилизацию мембраны. Проницаемость клеточной мембраны увеличивается, и в противном случае непроницаемые молекулы проникают в клетку. Хотя механизмы электропереноса генов еще полностью не изучены, было показано, что введение ДНК происходит только в части мембраны, обращенной к катоду, и что для успешной трансфекции необходимо несколько этапов: электрофоретическая миграция ДНК к клетке, ДНК вставка в мембрану, перемещение через мембрану, миграцию ДНК к ядру, перенос ДНК через ядерную оболочку и, наконец, экспрессия гена. Существует ряд факторов, которые могут влиять на эффективность электропереноса генов, таких как: температура, параметры электрических импульсов, концентрация ДНК, используемый буфер электропорации, размер клеток и способность клеток экспрессировать трансфецированные гены. При электропереносе гена in vivo решающее значение имеют также диффузия ДНК через внеклеточный матрикс, свойства ткани и общая проводимость ткани.
В 1960-х годах было известно, что при приложении внешнего электрического поля может быть создан большой мембранный потенциал на двух полюсах клетки. В 1970-х годах было обнаружено, что, когда мембранный потенциал достигает критического уровня, мембрана разрушается и может восстанавливаться. К 1980-м годам это отверстие использовалось для введения различных материалов / молекул в ячейки
