Нокаутирующая мышь

редактировать

A Нокаутирующая мышь или Нокаутирующая мышь - это генетически модифицированная мышь (Mus musculus), в котором исследователи инактивировали или «нокаутировали » существующий ген, заменив его или разрушив искусственным фрагментом ДНК. Они являются важными животными моделями для изучения роли генов, которые были секвенированы, но функции которых не были определены. Вызывая у мыши неактивность определенного гена и наблюдая любые отличия от нормального поведения или физиологии, исследователи могут сделать вывод о его вероятной функции.

Мыши в настоящее время являются видами лабораторных животных, наиболее близкими к людям, для которых можно легко применить метод нокаута. Они широко используются в экспериментах с нокаутом, особенно в тех, которые исследуют генетические вопросы, относящиеся к физиологии человека. Нокаут гена у крыс намного сложнее и стал возможен только с 2003 года.

Первая зарегистрированная мышь с нокаутом была создана Марио Р. Капеччи, Мартин Эванс и Оливер Смитис в 1989 году, за что им была присуждена Нобелевская премия 2007 года по физиологии и медицине. Некоторые аспекты технологии создания мышей-нокаутов и сами мыши были запатентованы во многих странах частными компаниями.

Содержание

  • 1 Использование
  • 2 Штаммы
  • 3 Процедура
  • 4 Ограничения
  • 5 См. Также
  • 6 Ссылки
  • 7 Внешние ссылки

Использование

Лаборатория мышь, у которой был отключен ген, влияющий на рост волос (слева), показана рядом с нормальной лабораторной мышью.

Выключение активности гена дает информацию о том, что этот ген обычно делает. У людей много общих генов с мышами. Следовательно, наблюдение за характеристиками мышей с нокаутом дает исследователям информацию, которая может быть использована для лучшего понимания того, как подобный ген может вызывать или способствовать заболеванию у людей.

Примеры исследований, в которых использовались нокаутные мыши, включают изучение и моделирование различных видов рака, ожирения, сердечных заболеваний, диабет, артрит, токсикомания, тревога, старение и болезнь Паркинсона. Нокаут-мыши также представляют собой биологический и научный контекст, в котором могут быть разработаны и испытаны лекарства и другие методы лечения.

Ежегодно в экспериментах используются миллионы мышей с нокаутом.

Штаммы

Мышь с нокаутом (слева), которая является моделью ожирения по сравнению с нормальной мышью.

Там несколько тысяч различных линий нокаутных мышей. Многие модели мышей названы в честь гена, который был инактивирован. Например, мышь с нокаутом p53 названа в честь гена p53, который кодирует белок, который обычно подавляет рост опухолей путем остановки деления клеток и / или индуцирование апоптоза. Люди, рожденные с мутациями, деактивирующими ген p53, страдают синдромом Ли-Фраумени, состоянием, которое резко увеличивает риск развития рака костей, рака груди и рака крови в раннем возрасте. Другие модели мышей названы в соответствии с их физическими характеристиками или поведением.

Процедура

Процедура создания бластоцисты смешанного генотипа. Схема разведения для получения мышей с нокаутом. Бластоцисты, содержащие клетки как дикого типа, так и клетки нокаута, вводят в матку приемной матери. В результате получается потомство дикого типа, окрашенное в тот же цвет, что и донор бластоцисты (серый), или химера (смешанная) и частично нокаутировано. Мышей-химер скрещивают с нормальной мышью дикого типа (серый цвет). Это дает потомство, которое является либо белым и гетерозиготным по нокаутированному гену, либо серым и диким типом. Белых гетерозиготных мышей можно впоследствии скрестить с получением мышей, гомозиготных по нокаутированному гену.

Существует несколько вариантов процедуры получения нокаутных мышей; Ниже приводится типичный пример.

  1. Ген, подлежащий нокауту, выделяют из библиотеки генов мыши. Затем конструируют новую последовательность ДНК , которая очень похожа на исходный ген и его ближайшую соседнюю последовательность, за исключением того, что она достаточно изменена, чтобы ген стал неработоспособным. Обычно новой последовательности также присваивается маркерный ген, ген, которого нет у нормальных мышей и который придает устойчивость к определенному токсическому агенту (например, неомицину) или который вызывает наблюдаемые изменения (например, цвет или флуоресценция). Кроме того, второй ген, такой как tk + герпеса, также включен в конструкцию, чтобы выполнить полный отбор.
  2. Эмбриональные стволовые клетки изолированы от мыши бластоцисты (очень молодой эмбрион ) и выращенный in vitro. В этом примере мы возьмем стволовые клетки от белой мыши.
  3. Новая последовательность из шага 1 вводится в стволовые клетки из шага 2 с помощью электропорации. Посредством естественного процесса гомологичной рекомбинации некоторые из электропорированных стволовых клеток будут включать новую последовательность с выключенным геном в свои хромосомы вместо исходного гена. Шансы на успешное событие рекомбинации относительно низки, поэтому большинство измененных клеток будет иметь новую последовательность только в одной из двух релевантных хромосом - они считаются гетерозиготными. Клетки, трансформированные вектором, содержащим ген устойчивости к неомицину и ген герпеса tk +, выращивают в растворе, содержащем неомицин и ганцикловир, для отбора трансформаций, произошедших посредством гомологичной рекомбинации. Любая вставка ДНК, которая произошла путем случайной вставки, погибнет, потому что они дают положительный результат как на ген устойчивости к неомицину, так и на ген герпеса tk +, продукт гена которого реагирует с ганцикловиром с образованием смертельного токсина. Более того, клетки, которые не интегрируют какой-либо генетический материал, имеют отрицательный результат по обоим генам и, следовательно, погибают в результате отравления неомицином.
  4. Эмбриональные стволовые клетки, содержащие нокаутный ген, выделяются из неизмененных клетки с использованием маркерного гена с шага 1. Например, неизмененные клетки можно убить с помощью токсичного агента, к которому измененные клетки устойчивы.
  5. Нокаутированные эмбриональные стволовые клетки с шага 4 вставляют в мышь бластоциста. В этом примере мы используем бластоцисты серой мыши. Бластоцисты теперь содержат два типа стволовых клеток: исходные (от серой мыши) и нокаутированные клетки (от белой мыши). Эти бластоцисты затем имплантируются в матку самок мышей, где они развиваются. Таким образом, новорожденные мыши будут химерами : некоторые части их тел являются результатом исходных стволовых клеток, другие части - нокаутированными стволовыми клетками. На их мехе будут белые и серые участки с белыми пятнами, полученными из нокаутированных стволовых клеток, и серыми пятнами от бластоцисты реципиента.
  6. У некоторых новорожденных мышей-химер будут гонады происходит из нокаутированных стволовых клеток и, следовательно, будет производить яйцеклетки или сперматозоиды, содержащие нокаутный ген. Когда этих химерных мышей скрещивают с другими мышами дикого типа, у некоторых из их потомков будет одна копия нокаутированного гена во всех их клетках. Эти мыши будут полностью белыми и не являются химерами, однако они все равно будут гетерозиготными.
  7. Когда эти гетерозиготные потомки скрещиваются, некоторые из их потомков унаследуют нокаутированный ген от обоих родителей; они не несут функциональную копию исходного неизмененного гена (т.е. они гомозиготны по этому аллелю).

Подробное объяснение того, как создаются нокаутные (KO) мыши, находится на веб-сайте Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007.

Ограничения

Национальные институты здравоохранения обсуждают некоторые важные ограничения этой техники.

Хотя технология нокаутирующих мышей представляет собой ценный исследовательский инструмент, существуют некоторые важные ограничения. Около 15 процентов нокаутов генов являются смертельными для развития, что означает, что генетически измененные эмбрионы не могут вырасти во взрослых мышей. Эту проблему часто преодолевают с помощью условных мутаций. Отсутствие взрослых мышей ограничивает исследования эмбриональным развитием и часто затрудняет определение функции гена в отношении здоровья человека. В некоторых случаях ген может выполнять иную функцию у взрослых, чем у развивающихся эмбрионов.

Нокаут гена также может не приводить к наблюдаемым изменениям у мышей или может даже давать характеристики, отличные от тех, которые наблюдаются у людей, у которых тот же ген инактивирован. Например, мутации в гене p53 связаны с более чем половиной случаев рака человека и часто приводят к опухолям в определенном наборе тканей. Однако, когда ген p53 отключен у мышей, у животных развиваются опухоли в другом массиве тканей.

Процедура в целом варьируется в зависимости от штамма, из которого были получены стволовые клетки. Обычно используются клетки, полученные из штамма 129. Этот специфический штамм не подходит для многих экспериментов (например, поведенческих), поэтому очень часто обратное скрещивание потомства с другими штаммами. Было доказано, что некоторые геномные локусы очень трудно выбить. Причиной может быть наличие повторяющихся последовательностей, обширное метилирование ДНК или гетерохроматин. Смешивающее присутствие соседних 129 генов в нокаутном сегменте генетического материала было названо «эффектом фланкирующего гена». Были предложены методы и руководящие принципы для решения этой проблемы.

Еще одним ограничением является то, что мыши с обычным (т.е. не-условным) нокаутом развиваются в отсутствие исследуемого гена. Иногда потеря активности во время развития может маскировать роль гена во взрослом состоянии, особенно если ген участвует во многих процессах, охватывающих развитие. Затем требуются подходы к условной / индуцибельной мутации, которые сначала позволяют мыши нормально развиваться и созревать до удаления интересующего гена.

Еще одним серьезным ограничением является отсутствие эволюционных адаптаций в модели нокаута, которые могут иметь место у животных дикого типа после их естественной мутации. Например, специфическая для эритроцитов коэкспрессия GLUT1 с стоматином представляет собой компенсаторный механизм у млекопитающих, которые не могут синтезировать витамин C.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-05-25 11:35:49
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте