Войти
Индуцированные стволовые клетки (iSC ) - это стволовые клетки, полученные из соматические, репродуктивные, плюрипотентные или другие типы клеток путем преднамеренного эпигенетического репрограммирования. Они классифицируются как тотипотентные (iTC), плюрипотентные (iPSC) или предшественники (мультипотентные - iMSC, также называемые индуцированными мультипотентными клетками-предшественниками - iMPC) или унипотентные - (iUSC) в соответствии с их потенциалом развития и степенью дедифференцировки. Предшественники получают путем так называемого прямого репрограммирования или направленной дифференцировки и также называются индуцированными соматическими стволовыми клетками.
Три метода широко известны:
В 1895 году Томас Морган удалил один из двух бластомеров лягушки и обнаружил, что амфибии способны формировать целые эмбрионы из оставшейся части. Это означало, что клетки могут изменять свой путь дифференцировки. В 1924 году Спеманн и Мангольд продемонстрировали ключевое значение клеточно-клеточной индукции в процессе развития животных. Обратимое преобразование клеток одного дифференцированного типа клеток в другой называется метаплазией. Этот переход может быть частью нормального процесса созревания или вызван побуждением.
Одним из примеров является трансформация клеток радужки в клетки хрусталика в процессе созревания и трансформации клеток пигментного эпителия сетчатки в нервные клетки. сетчатка во время регенерации у взрослых тритонов глаз. Этот процесс позволяет организму заменять клетки, не подходящие для новых условий, более подходящими новыми клетками. В имагинальных дисках Drosophila клетки должны выбирать из ограниченного числа стандартных состояний дискретной дифференцировки. Тот факт, что трансдетерминация (изменение пути дифференцировки) часто происходит для группы клеток, а не для отдельных клеток, показывает, что она вызывается, а не является частью созревания.
Исследователям удалось определить минимальные условия и факторов, которых было бы достаточно для запуска каскада молекулярных и клеточных процессов, чтобы дать команду плюрипотентным клеткам организовать эмбрион. Они показали, что противоположные градиенты костного морфогенетического белка (BMP) и Nodal, двух членов семейства трансформирующего фактора роста, которые действуют как морфогены, достаточны для индукции молекулярных и клеточных механизмов, необходимых для организации in vivo или in vitro незафиксированных клеток рыбок данио бластула животный полюс в хорошо развитый эмбрион.
Некоторые типы зрелых специализированных взрослых клеток могут естественным образом превращаться в стволовые клетки. Например, «главные» клетки экспрессируют маркер стволовых клеток Troy. Хотя они обычно производят пищеварительную жидкость для желудка, они могут превращаться в стволовые клетки для временного ремонта повреждений желудка, таких как порез или повреждение от инфекции. Более того, они могут совершать этот переход даже при отсутствии заметных повреждений и способны восполнить целые желудочные единицы, по сути выступая в качестве покоящихся «резервных» стволовых клеток. Дифференцированные эпителиальные клетки дыхательных путей могут превращаться в стабильные и функциональные стволовые клетки in vivo. После повреждения зрелые окончательно дифференцированные клетки почек дедифференцируются в более примордиальные версии самих себя и затем дифференцируются в типы клеток, нуждающиеся в замене в поврежденной ткани. Макрофаги могут самообновляться за счет локальной пролиферации зрелых дифференцированных клеток. У тритонов мышечная ткань регенерируется из специализированных мышечных клеток, которые дедифференцируются и забывают тип клеток, которым они были. Эта способность к регенерации не снижается с возрастом и может быть связана с их способностью производить новые стволовые клетки из мышечных клеток по требованию.
Разнообразные неопухолевые стволовые клетки обладают способностью генерировать несколько типов клеток. Например, многолинейно дифференцирующиеся стрессоустойчивые клетки (Muse) представляют собой стрессоустойчивые стволовые клетки взрослого человека, которые могут самообновляться. Они образуют характерные кластеры клеток в суспензионной культуре, которые экспрессируют набор генов, связанных с плюрипотентностью, и могут дифференцироваться в энтодермальные, эктодермальные и мезодермальные клетки как in vitro, так и in vivo.
Другие хорошо задокументированные подробно описаны примеры трансдифференцировки и их значение в развитии и регенерации.
Индуцированные тотипотентные клетки обычно можно получить путем перепрограммирования соматических клеток с помощью переноса ядра соматических клеток (SCNT). Индуцированные тотипотентные клетки могут быть получены путем перепрограммирования соматических клеток с помощью переноса ядра соматической клетки (SCNT). Процесс включает в себя отсасывание ядра соматической (телесной) клетки и введение его в ооцит, ядро которого было удалено
Используя подход, основанный на протоколе, описанном Tachibana et al., Можно создать чЭСК с помощью SCNT с использованием ядер дермальных фибробластов как от 35-летнего мужчины среднего возраста, так и от пожилого, 75-летнего мужчины, предполагая, что возрастные изменения не обязательно являются препятствием для основанного на SCNT ядерного репрограммирования человеческих клеток. Такое перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние имеет огромные возможности для регенеративной медицины. К сожалению, клетки, созданные с помощью этой технологии, потенциально не полностью защищены от иммунной системы пациента (донора ядер), потому что они имеют ту же митохондриальную ДНК, что и донорская ооцитов, а не митохондриальной ДНК пациентов. Это снижает их ценность в качестве источника терапии трансплантации аутологичных стволовых клеток, поскольку в настоящее время неясно, может ли она вызвать иммунный ответ пациента после лечения.
Индуцированные андрогенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки могут использоваться вместо сперматозоидов для клонирования. Эти клетки, синхронизированные в фазе М и введенные в ооцит, могут дать жизнеспособное потомство.
Эти разработки, вместе с данными о возможности неограниченного количества ооцитов из митотически активных репродуктивных стволовых клеток, предлагают возможность промышленного производства трансгенных домашний скот. Повторное повторное клонирование жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, который включает ингибитор гистондеацетилазы, трихостатин, добавленный в среду для культивирования клеток, показывает, что можно повторно клонировать животных на неопределенный срок без видимого накопления ошибок перепрограммирования или геномных ошибок. Однако исследования технологий получения сперматозоидов и яйцеклеток из стволовых клеток поднимают биоэтические вопросы.
Такие технологии также могут иметь далеко идущие клинические применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека. Например, эта технология может предотвратить передачу наследственных митохондриальных заболеваний будущим поколениям. Митохондриальный генетический материал передается от матери к ребенку. Мутации могут вызывать диабет, глухоту, нарушения зрения, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, слабоумие и другие неврологические заболевания. Ядро одного человеческого яйца было перенесено в другое, включая его митохондрии, в результате чего образовалась клетка, которая может считаться имеющей двух матерей. Затем яйца были оплодотворены, и полученные эмбриональные стволовые клетки несли замененную митохондриальную ДНК. В качестве доказательства того, что метод безопасен, автор этого метода указывает на существование здоровых обезьян, которым сейчас более четырех лет - и они являются продуктом митохондриальных трансплантатов с разным генетическим происхождением.
В позднем поколении. теломеразодефицитных (Terc - / -) мышей, SCNT-опосредованное перепрограммирование смягчает теломерную дисфункцию и митохондриальные дефекты в большей степени, чем репрограммирование на основе ИПСК.
Другие достижения в клонировании и тотипотентной трансформации имеют
Недавно некоторым исследователям удалось получить тотипотентные клетки без помощи SCNT. Тотипотентные клетки получали с использованием эпигенетических факторов, таких как зародышевая изоформа гистона ооцита. Перепрограммирование in vivo путем временной индукции четырех факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc у мышей придает свойства тотипотентности. Внутрибрюшинная инъекция таких iPS-клеток in vivo создает эмбрионоподобные структуры, которые экспрессируют эмбриональные и внеэмбриональные (трофэктодермальные ) маркеры. Потенциал развития плюрипотентных стволовых клеток мыши давать как эмбриональные, так и экстраэмбриональные клоны также может быть увеличен за счет дефицита микроРНК miR-34a, что приводит к сильной индукции эндогенных ретровирусов MuERV-L ( MERVL).
Трансплантация плюрипотентных / эмбриональных стволовых клеток в организм взрослых млекопитающих обычно приводит к образованию тератом, которые затем могут превратиться в злокачественную опухоль. опухоль тератокарциномы. Однако введение клеток тератокарциномы в эмбрион на стадии бластоцисты вызывало их включение в клеточную массу и часто приводило к образованию нормальных здоровых химерных (то есть состоящих из клеток разных организмов) животных ИПСК были сначала получены в форме трансплантируемая тератокарцинома, индуцированная трансплантатами, взятыми из эмбрионов мыши. Тератокарцинома образовалась из соматических клеток. Генетически мозаичных мышей были получены из клеток злокачественной тератокарциномы, что подтверждает плюрипотентность клеток. Оказалось, что клетки тератокарциномы способны поддерживать культуру плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в недифференцированном состоянии, снабжая культуральную среду различными факторами. В 1980-х годах стало ясно, что трансплантация плюрипотентных / эмбриональных стволовых клеток в организм взрослых млекопитающих обычно приводит к образованию тератом, которые затем могут превратиться в тератокарциному злокачественной опухоли. Однако введение клеток тератокарциномы в эмбрион на стадии бластоцисты вызывало их включение во внутреннюю клеточную массу и часто приводило к образованию нормального химерного (т.е. состоящего из клеток разных организмов) животного. Это указывало на то, что причиной тератомы является диссонанс - взаимное недопонимание между молодыми донорскими клетками и окружающими взрослыми клетками (так называемая «ниша »).
В августе 2006 г. японские исследователи отказались от ооцита, как в случае с SCNT. Путем репрограммирования эмбриональных фибробластов мыши в плюрипотентные стволовые клетки посредством эктопической экспрессии четырех факторов транскрипции, а именно Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, они доказали, что сверхэкспрессия небольшого количества факторов может подтолкнуть клетку к переходу в новое стабильное состояние, которое связано с изменениями активности тысяч генов.
Соматические клетки человека становятся плюрипотентными за счет трансдукции их факторами, индуцирующими плюрипотентность (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG и LIN28). Это приводит к производству клеток IPS, которые могут дифференцироваться в любые клетки трех зародышевых листков эмбриона (мезодерма, энтодерма, эктодерма). Таким образом, механизмы репрограммирования связаны, а не независимы, и сосредоточены на небольшом количестве генов.. Свойства IPSC очень похожи на ESC. Было показано, что ИПСК поддерживают развитие мышей с полностью ИПСК с использованием эмбриона тетраплоид (4n), что является наиболее строгим методом анализа потенциала развития. Однако некоторые генетически нормальные ИПСК не смогли продуцировать полностью ИПСК мышей из-за аберрантного эпигенетического молчания импринтированного кластера гена Dlk1-Dio3. Команда, возглавляемая Хансом Шёлером (открывшим ген Oct4 еще в 1989 году), показала, что сверхэкспрессия Oct4 вызывает массовую активацию нецелевого гена во время репрограммирования, ухудшая качество ИПСК. По сравнению с OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), которые демонстрируют паттерны патологического импринтинга и дифференцировки, перепрограммирование SKM (Sox2, Klf4 и c-Myc) генерирует ИПСК с высоким потенциалом развития (почти в 20 раз выше, чем у OSKM). эквивалент эмбриональных стволовых клеток, что определяется их способностью генерировать мышей, полностью содержащих ИПСК, посредством комплементации тетраплоидных эмбрионов
Важным преимуществом ИПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из взрослых клеток а не из эмбрионов. Таким образом, стало возможным получать ИПСК от взрослых и даже пожилых пациентов.
Перепрограммирование соматических клеток на ИПСК приводит к омоложению. Было обнаружено, что репрограммирование приводит к удлинению и последующему укорочению теломер после их дифференцировки обратно в фибробластоподобные производные. Таким образом, репрограммирование приводит к восстановлению длины теломер эмбриона и, следовательно, увеличивает потенциальное число клеточных делений, которое иначе ограничивалось пределом Хейфлика.
Однако из-за диссонанса между омоложенными клетками и окружающей нишей более старых клеток реципиента. клеток, инъекция его собственного ИПСК обычно приводит к иммунному ответу, который может быть использован в медицинских целях, или к образованию опухолей, таких как тератома. Было выдвинуто предположение, что причина в том, что некоторые клетки, дифференцированные от ESC и iPSC in vivo, продолжают синтезировать эмбриональные изоформы белка. Таким образом, иммунная система может обнаруживать и атаковать клетки, которые не взаимодействуют должным образом.
Небольшая молекула под названием MitoBloCK-6 может заставить плюрипотентные стволовые клетки умирать, вызывая апоптоз (посредством высвобождения цитохрома c через митохондрии внешняя мембрана) в плюрипотентных стволовых клетках человека, но не в дифференцированных клетках. Вскоре после дифференцировки дочерние клетки стали устойчивыми к смерти. Когда MitoBloCK-6 вводили в дифференцированные клеточные линии, клетки оставались здоровыми. Было предположено, что ключ к их выживанию связан с изменениями, которым подвергаются митохондрии плюрипотентных стволовых клеток в процессе клеточной дифференцировки. Эта способность MitoBloCK-6 разделять плюрипотентные и дифференцированные клеточные линии может снизить риск тератом и других проблем в регенеративной медицине.
В 2012 году другие малые молекулы (селективные цитотоксические были идентифицированы ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), которые предотвращали образование тератом у мышей плюрипотентными стволовыми клетками человека. Наиболее сильное и селективное из них (PluriSIn # 1) ингибирует стеароил-coA десатуразу (ключевой фермент в биосинтезе олеиновой кислоты ), что в конечном итоге приводит к апоптозу. С помощью этой молекулы недифференцированные клетки могут быть выборочно удалены из культуры. Эффективная стратегия селективного устранения плюрипотентных клеток с потенциалом тератомы заключается в нацеливании на специфический для плюрипотентных стволовых клеток антиапоптотический фактор (ы) (т.е. сурвивин или Bcl10). Однократная обработка химическими ингибиторами сурвивина (например, кверцетином или YM155) может вызвать селективную и полную гибель клеток недифференцированных hPSC и, как утверждается, является достаточной для предотвращения образования тератомы после трансплантации. Однако маловероятно, что какое-либо предварительное разрешение может обеспечить повторную посадку iPSC или ESC. После избирательного удаления плюрипотентных клеток они быстро появляются снова, превращая дифференцированные клетки в стволовые, что приводит к опухолям. Это может быть связано с нарушением регуляции let-7 его мишени Nr6a1 (также известного как ядерный фактор зародышевой клетки - GCNF), эмбрионального репрессора транскрипции генов плюрипотентности, который регулирует ген экспрессия во взрослых фибробластах после потери микро-РНК миРНК.
Формирование тератомы плюрипотентными стволовыми клетками может быть вызвано низкой активностью фермента PTEN, который, как сообщается, способствует выживанию небольшой популяции (0,1–5% от общей популяции) высоко онкогенных, агрессивных, вызывающих тератому эмбрионоподобных клеток карциномы во время дифференцировки. Выживание этих клеток, инициирующих тератому, связано с неудачной репрессией Nanog, а также со склонностью к увеличению метаболизма глюкозы и холестерина. Эти инициирующие тератому клетки также экспрессировали более низкое соотношение p53 / p21 по сравнению с неканцерогенными клетками. В связи с указанными выше проблемами безопасности использование ИПСК дляклеточной терапии все еще ограничено. Однако их можно использовать для множества других целей, включая моделирование заболеваний, скрининг (выборочный отбор) лекарств, тестирование токсичности различных лекарств.
Модуляторы малых молекул судьбы стволовых клеток. Ткань выращенные из ИПСК, помещенные в «химерные» эмбрионы на ранних стадиях развития мышей, практически не вызывают иммунного ответа (после того, как эмбрионы выросли во взрослых мышей) и подходят для аутологичной трансплантации В то же Время полной перепрограммирования взрослых клеток in vivo в тканях путем временной индукции четырех факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc у мышей приводит к тератомам, появляющимся из множества органов. Более того, частичное перепрограммирование клеток в сторону плюрипотентности in vivo у мышей демонстрирует, что неполное репрограммирование влечет за собой эпигенетические изменения (неудачное подавление мишеней Polycomb и измененное метилирование ДНК ) в клетках, которые вызывают развитие рака. 589>Пример клеточной культуры с небольшой молекулой как инструментом вместо белка. в культуре клеток для получения панкреатического клона из мезодермальных стволовых клеток должен быть активирован путь передачи сигналов ретиноевой кислоты в то время как путь sonic hedgehog ингибируется, что может быть сделано путем добавления к media anti-shh антител, взаимодействующий белок Hedgehog или циклопамин, первые два предоставить собой белок, а последний - небольшую молекулу.
Используя исключительно небольшие молекулы, Дэн Хункуй и его коллеги, что эндогенный "мастер-генов" достаточно для перепрограммирования клеточной судьбы. Они индуцировали плюрипотентное состояние во взрослых мышей, используя семь низкомолекулярных соединений. Эффективность метода высока: он смог преобразовать 0,02% клеток взрослой ткани в ИПСК, что сопоставимо со скоростью конверсии вставки гена. Авторы отмечают, что мыши, полученные из CiPSC, были «на 100% жизнеспособными и, по-видимому, здоровыми на срок до 6 месяцев». Таким образом, эта программа химического репрограммирования [1] Введение в штатные программы введенных типов клеток для клинических применений.
В 2015 году была создана надежная система химического репмирования, производительность которой в 1000 раз выше, чем у ранее описанного протокола.. Таким образом, химическое репрограммирование стало многообещающим подходом к изменению судьбы клетки.
Тот факт, что ИПСК человека образовывать тератомы не только у людей, но и у некоторых животных, в частности, у мышей или свиней, что разработано метод дифференциации ИПСК in vivo. С помощью этой цели ИП с агентом для индукции дифференцировки в клетки-мишени вводят генетически модифицированной свиньи или мыши, подавлена активация иммунной системы на клетках человека. Образовавшаяся тератома вырезается и используется для выделения необходимых дифференцированных клеток человека с помощью моноклонального антитела к тканеспецифическим маркерам на поверхности этих клеток. Этот метод успешно используется для улучшения функциональных возможностей миелоидных, эритроидных и лимфоидных клеток человека, пригодных для трансплантации (пока только мышам). Мыши, которым прививали гематопоэтические клетки, происходящие из тератомы ИПСК человека, продуцировали В- и Т-клетки человека, способные к функциональным иммунным ответам. Эти результаты дают надежду на то, что создание человеческих антител и скрининга лекарств in vivo может быть полезно для пациентов, полезных материалов, которые могут быть полезны для трансплантации, получения человеческих антител и скрининга лекарств. Используя MitoBloCK-6 и / или PluriSIn # 1, дифференцированные клетки-предшественники можно дополнительно очистить от тератомы, образующую плюрипотентные клетки. Тот факт, что дифференцировка происходит даже в нише тератомы, дает надежду на то, что полученные клетки будут достаточно стабильными для стимулов, способ их вызвать переход обратно в дедифференцированное (плюрипотентное) состояние и, следовательно, безопасными. Сходная система дифференцировки in vivo, дающая приживляемые гемопоэтические стволовые клетки из ИПСК мыши и человека у животных с тератомой, в сочетании с маневром для облегчения кроветворения, была описана Suzuki et al. Они отметили, что ни лейкемия, ни опухоли не наблюдались у реципиентов после внутривенной инъекции, полученной из ИПСК гемопоэтических стволовых клеток облученным реципиентам. Более того, эта инъекция привела к многолинейному и долгосрочному восстановлению гемолимфопоэтической системы при серийных переносах. Такая система представляет собой полезный инструмент для практического применения ИПСК при лечении гематологических и иммунологических заболеваний.
Для дальнейшего развития этого животного, в котором выращивают трансплантат клетки человека, например, мышь, должна быть таким модифицированным образом. геном, экспрессируемый всеми клетками и имеющий на поверхности человеческий SIRPα. Чтобы предотвратить отторжение после трансплантации пациенту аллогенного органа или ткани, выращенных из плюрипотентных стволовых клеток in vivo у животного, клетки должны экспрессировать две молекулы: CTLA4-Ig, который нарушает костимуляторные пути Т-клеток. и PD-L1, который активирует путь ингибирования Т-клеток.
См. также: патент США 20130058900.
В ближайшем будущем испытании безопасные условия использования ИПСК для клеточной терапии людей с возрастом: начнется связанная с этим дегенерация желтого пятна - заболевание, вызывающее слепоту из-за повреждений сетчатки. Есть несколько статей, описывающих методы получения клеток сетчатки из ИПСК и их использование для клеточной терапии. Сообщения о трансплантации пигментного эпителия сетчатки, полученного с помощью ИПСК, показаны улучшенное визуально-управляемое поведение экспериментальных животных в течение 6 недель после трансплантации. Однако клинические испытания были успешными: у десяти пациентов, страдающих пигментным ретинитом, было восстановлено зрение, включая женщину, у которой есть только 17 процентов зрения.
Хронические заболевания легких, такие как идиопатический фиброз легких и кистозный фиброз или хроническая обструктивная болезнь легких и астма, являются ведущими причинами заболеваемости и смертности во всем мире, вызывая значительное человеческое, социальное и финансовое бремя. Таким образом, существует острая необходимость в эффективной клеточной терапии и легкой тканевой инженерии. Было разработано несколько протоколов для генерации различных типов клеток дыхательной системы, которые могут быть полезны для использования терапевтических клеток, специфичных для пациента.
Некоторые линии ИПСК обладают потенциалом дифференцироваться в мужские половые клетки и клетки ооцитоподобных клеток в системе нише (путем культивирования в ретиноевой кислоте и среде дифференцировки фолликулярной жидкости свиньи или трансплантации сем канальцев). Более того, трансплантация ИПСК вносит вклад в восстановление семенников бесплодных мышей, демонстрируя возможность образования гамет из ИПСК in vivo и in vitro.
Риск рака и опухолей требует разработки методов более безопасных клеточных линий, подходящих для клинического использования. Альтернативный подход - так называемое «прямое репрограммирование» - трансдифференцировка клеток без перехода через плюрипотентное состояние. Основанием для этого подхода было то, что 5-азацитидин - реагент деметилирования ДНК - может вызвать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонов в бессмертной клеточной линии эмбриональных фибробластов мыши и что такого перепрограммирования достаточно активации одного гена, позже названного MyoD1. По сравнению с ИП, для репрограммирования, которое требуется не менее двух недель, образование индуцированных клеток-предшественников иногда происходит в течение нескольких дней, эффективность репрограммирования обычно во много раз выше. Это перепрограммирование не всегда требует деления клеток. Клетки, полученные в результате такой перепрограммирования, подходят для клеточной терапии, поскольку они не образуют тератом. Например, Chandrakanthan et al., Pimanda описывают создание ткане-регенеративных мультипотентных стволовых клеток (iMS-клеток) путем временной обработки зрелых костей и жировых клеток фактора роста (тромбоцитарный фактор роста –AB (PDGF-AB)) и 5-азацитидин. Эти авторы утверждают, что: «В отличие от первичных мезенхимальных стволовых клеток, которые используются в клинической практике с небольшим набором объективных данных для ускорения восстановления тканей, iMS-клетки вносят непосредственный вклад в регенерацию ткани in vivo, контекстно-зависимым образом, не образуя опухоли», и поэтому большие возможности для применения в регенерации тканей ».
Первоначально только ранние эмбриональные клетки можно было уговорить изменить свою идентичность. Зрелые клетки устойчивой к изменению своей личности после того, как они перейдут к определенному виду. Однако фактор кратковременной экспрессии одного фактора транскрипции, фактора ELT-7 GATA, может преобразовать идентичность полностью дифференцированных, представленных неэнтодермальных клеток глотки в полностью дифференцированные кишечные клетки у интактных личинок. и взрослые круглые черви Caenorhabditis elegans потребности в дедифференцированном промежуточном продукте.
Судьбой клетки можно эффективно управлять с помощью. В частности, путем прямой активации экспрессии специфического эндогенного гена с помощью CRISPR -опосредованного активатора. Когда dCas9 (который был модифицирован так, что он больше не разрезает ДНК, но все еще может быть направлен к конкретным последовательностям и связываться с ними) комбинируется с активаторами транскрипции, он может точно управлять экспрессией эндогенных генов. Используя этот метод, Wei et al. Усилили экспресс-эндогенных генов Cdx2 и Gata6 с помощью активаторов, опосредованных CRISPR, таким образом, напрямую преобразовав эмбриональные стволовые клетки мыши в двеэмбриональные линии, т. Е. типичные стволовые клетки трофобласта и клетки внеэмбриональной энтодермы. Аналогичный подход был использован для индукции активации эндогенных генов Brn2, Ascl1 и Myt1l для преобразования эмбриональных фибробластов мыши в индуцированные нейрональные клетки. Таким образом, активация транскрипции и эпигенетическое ремоделирование эндогенных основных факторов транскрипции достаточны для конверсии между типами клеток. Быстрая и устойчивая активация эндогенных генов в их природном хроматиновом контексте с помощью этого подхода может облегчить репрограммирование с помощью временных методов, которые избегают геномной интеграции и новой стратегии преодоления эпигенетических барьеров на пути спецификации клеточных судеб.
Другой способ перепрограммирования - моделирование процессов, которые происходят во время регенерации конечностей амфибии. У амфибий уроделе ранней стадией регенерации конечностей является дедифференцировка клеточного скелетных мышц доочных элементов, которые пролиферируют в ткани конечностей. Последовательная обработка мышечных волокон низкомолекулярными веществами миосеверином, реверсином (ингибитор киназы Aurora B ) и другими химическими веществами: BIO (ингибитор киназы гликогенсинтазы-3), лизофосфатидная кислота (плейотропный активатор рецепторов, связанных с G-белком), SB203580 (ингибитор p38 MAP-киназы ) или (ингибитор аденилатциклазы) вызывает образование новых мышц клеток, а также других клеток, такие как клетки-предшественники жировой, костной и нервной системы.
Исследователи обнаружили, что GCSF -имитация антитело может активировать рецептор, стимулирующий рост, на клетках костного мозга таким образом, чтобы индуцировать стволовые клетки костного мозга, обычно развиваются лейкоциты, становиться клетками-предшественниками нейронов. Этот метод позволяет исследователям искать большие библиотеки антител и быстро выбирать те, которые обладают желаемым биологическим эффектом.
Желудочно-кишечный тракт человека заселенным сообществом симбионтов и комменсалов.. Исследователи демонстрируют феномен репрограммирования соматических клеток, бактерий и генерации мультипотенциальных клеток, дермальных фибробластов, взрослых человека путем включения молочнокислых бактерий. Эта клеточная трансдифференцировка вызывается рибосомами и «может происходить через донорские бактерии, которые проглатываются и перевариваются клетками-хозяевами. которые могут вызывать рибосомный стресс и стимулировать пластичность клеточного развития ».
Шлегель и люк, что комбинация питающих клеток и ингибитора киназы Rho (Y-27632) индуцирует размножение нормальных и опухолевых эпителиальных клеток из многих тканей на неопределенный срок in vitro. Этот процесс происходит без необходимости трансдукции экзогенных вирусных или клеточных генов. Эти клетки были названы «условно перепрограммированными клетками (CRC)». Индукция CRC происходит быстро и является результатом перепрограммирования всей популяции клеток. CRC не экспрессируют высокие уровни белков, характерных для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (например, Sox2, Oct4, Nanog или Klf4). Эта индукция CRC обратима, и удаление Y-27632 и питателей позволяет клеткам нормально дифференцироваться. Технология CRC может генерировать 2 × 10 клеток за 5-6 дней из биопсии иглы и может генерировать культуры из криоконсервированной ткани и менее чем из четырех жизнеспособных клеток. CRC сохраняют нормальный кариотип и остаются неопухолевыми. Этот метод также позволяет эффективно создавать культуры клеток из опухолей человека и грызунов.
Способность быстро генерировать множество опухолевых клеток из небольших образцов биопсии и замороженной ткани предоставляет значительные возможности для клеточной диагностики и лечения (включая тестирование на химиочувствительность) и значительно увеличивает ценность биобанкинга. Используя технологию CRC, исследователи смогли определить эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легкого. Группа Энглемана описывает фармакогеномную платформу, которая способствует быстрому открытию комбинаций лекарственных препаратов, которые могут преодолевать резистентность с помощью системы CRC. Кроме того, метод CRC позволяет проводить генетические манипуляции с эпителиальными клетками ex vivo и их последующую оценку in vivo у одного и того же хозяина. В то время как первоначальные исследования показали, что совместное культивирование эпителиальных клеток с клетками Swiss 3T3 J2 было необходимо для индукции CRC, при использовании планшетов для культивирования через лунки физический контакт между питающими клетками и эпителиальными клетками не требуется для индукции CRC и, что более важно, требуется облучение питающих клеток. для этой индукции. В соответствии с экспериментами трансвелл, кондиционированная среда индуцирует и поддерживает CRC, что сопровождается одновременным повышением активности клеточной теломеразы. Активность кондиционированной среды напрямую коррелирует с апоптозом питательных клеток, индуцированным радиацией. Таким образом, условное перепрограммирование эпителиальных клеток опосредуется комбинацией Y-27632 и растворимого фактора (ов), высвобождаемого апоптотическими питающими клетками.
Riegel et al. демонстрируют, что мышиные ME клетки, выделенные из нормальных молочных желез или из опухолей молочной железы, индуцированных вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV) -Neu, можно культивировать неограниченное время как условно перепрограммированные клетки (CRC). Маркеры, ассоциированные с клеточными предшественниками, быстро индуцируются в нормальных ME-CRC мыши по сравнению с ME-клетками. Однако экспрессия определенных субпопуляций предшественников молочной железы, таких как CD49f + ESA + CD44 +, значительно снижается на более поздних пассажах. Тем не менее, мышиные ME-CRCs, выращенные в трехмерном внеклеточном матриксе, дали начало ацинарным структурам молочных желез. ME-CRC, выделенные из опухолей молочной железы трансгенных мышей MMTV-Neu, экспрессируют высокие уровни HER2 / neu, а также маркеры опухолевых клеток, такие как CD44 +, CD49f + и ESA + (EpCam). Эти паттерны экспрессии поддерживаются в более поздних пассажах CRC. У ME-CRC раннего и позднего пассажа из опухолей MMTV-Neu, которые были имплантированы в жировые подушечки молочных желез сингенных или голых мышей, развивались сосудистые опухоли, которые метастазировали в течение 6 недель после трансплантации. Важно отметить, что гистопатология этих опухолей неотличима от гистопатологии родительских опухолей, которые развиваются у мышей MMTV-Neu. Применение системы CRC к эпителиальным клеткам молочной железы мышей обеспечивает привлекательную модельную систему для изучения генетики и фенотипа нормального и трансформированного эпителия мышей в определенной культуральной среде и исследований трансплантатов in vivo.
Другой подход к CRC заключается в ингибировании CD47 - мембранного белка, который является рецептором тромбоспондина-1. Потеря CD47 делает возможным устойчивую пролиферацию первичных эндотелиальных клеток мышиных, увеличивает асимметричное деление и позволяет этим клеткам спонтанно репрограммироваться с образованием мультипотентных эмбриоидных -подобных тел. CD47 нокда резко увеличивает уровни мРНК c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток в клетках in vitro и in vivo. Тромбоспондин-1 является сигналом окружающей среды, который ингибирует самообновление стволовых клеток через CD47. Таким образом, антагонисты CD47 делают возможным самообновление и перепрограммирование клеток, преодолевая негативную регуляцию c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток. Блокада CD47 in vivo с использованием антисмыслового морфолино увеличивает выживаемость мышей, подвергшихся летальному облучению всего тела из-за повышенной пролиферативной способности клеток, полученных из клеток мозга и радиозащиты, радиочувствительных тканей желудочно-кишечного тракта.
Дифференцированные макрофаги могут самообновляться в тканях и длительно разрастаться в культуре. При определенных условиях макрофаги могут делиться, не теряя свойств, которые они приобрели при специализации в иммунных клетках, что обычно невозможно с дифференцированными клетками. Макрофаги достигают этого путем активации генной сети, аналогичной той, что обнаруживается в эмбриональных стволовых клетках. Анализ отдельных клеток показал, что in vivo пролиферирующие макрофаги могут подавлять репертуар специфичных для макрофагов энхансеров, связанных с генной сетью, контролирующей самообновление. Это произошло, когда концентрации двух факторов транскрипции, названных MafB и c-Maf, были естественно низкими или подавлялись в течение короткого времени. Генетические манипуляции, которые отключили MafB и c-Maf в макрофагах, заставили клетки запустить программу самообновления. Подобная сеть также контролирует самообновление эмбриональных стволовых клеток, но связана с отдельными энхансерами, специфичными для эмбриональных стволовых клеток.
Следовательно, макрофаги, изолированные от мышей с дефицитом MafB и c-Maf-double, делятся бесконечно; самообновление зависит от c-Myc и Klf4.
Непрямое преобразование клонов - это методология перепрограммирования, при которой соматические клетки переходят через пластичное промежуточное состояние частично перепрограммированные клетки (пре-ИПСК), индуцированные кратковременным воздействием факторов репрограммирования с последующей дифференцировкой в специально разработанной химической среде (искусственная ниша).
Этот метод мог бы быть как более эффективным, так и более безопасным, поскольку он действительно не вызывает опухолей или других нежелательных генетических изменений и дает гораздо больший урожай, чем другие методы. Однако безопасность этих клеток остается под вопросом. Поскольку преобразование клонов из пре-ИПСК зависит от использования условий перепрограммирования ИПСК, часть клеток может приобрести плюрипотентные свойства, если они не остановят процесс де-дифференцировки in vitro или из-за дальнейшей де-дифференцировки in vivo.
Общей чертой плюрипотентных стволовых клеток является специфическая природа белкового гликозилирования их внешней мембраны. Это отличает их от большинства неплюрипотентных клеток, но не от лейкоцитов. гликаны на поверхности стволовых клеток быстро реагируют на изменения клеточного состояния и передачи сигналов и поэтому идеально подходят для выявления даже незначительных изменений в популяциях клеток. Многие маркеры стволовых клеток основаны на гликановых эпитопах клеточной поверхности, включая широко используемые маркеры SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81. Suila Heli et al. предполагают, что в человеческих стволовых клетках внеклеточный O-GlcNAc и внеклеточный O-LacNAc играют решающую роль в тонкой настройке сигнального пути Notch - высококонсервативной клеточной сигнальной системы, которая регулирует спецификацию клеточной судьбы, дифференцировку, лево-правая асимметрия, апоптоз, сомитогенез, ангиогенез и играет ключевую роль в пролиферации стволовых клеток (обзор Perdigoto, Bardin и Jafar-Nejad et al.)
Изменения гликозилирования белков внешней мембраны являются маркерами состояний клеток каким-то образом связаны с плюрипотентностью и дифференциацией. Изменение гликозилирования, по-видимому, является не только результатом инициализации экспрессии гена, но и выступает в качестве важного регулятора гена, участвующего в приобретении и поддержании недифференцированного состояния.
Например, активация гликопротеина ACA, связывающий гликозилфосфатидилинозитол на поверхности клеток-предшественников в периферической крови человека, индуцирует повышенную экспрессию генов Wnt, Notch-1, BMI1 и HOXB4 через сигнальный каскад PI3K / Akt / mTor / PTEN и способствует образованию самообновляющегося популяция гемопоэтических стволовых клеток.
Кроме того, дедифференцировка клеток-предшественников, индуцированная ACA-зависимым сигнальным путем, приводит к ACA-индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам, способным дифференцироваться in vitro в клетки всех трех зародышевых листков. Изучение способности лектинов поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека привело к открытию лектина Erythrina crista-galli (ECA), который может служить простым и высокоэффективным эффективная матрица для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека.
Альтернативной стратегией преобразования соматических клеток в плюрипотентные состояния может быть непрерывная стимуляция фибробластов одним ECM протеогликан, фибромодулин. Такие клетки проявляют способность к регенерации скелетных мышц с заметно меньшим канцерогенным риском по сравнению с ИПСК. Снижение онкогенности таких клеток связано с активацией CDKN2B во время процесса репрограммирования рекомбинантного человеческого фибромодулина
Белок клеточной адгезии E-кадгерин необходим для устойчивый плюрипотентный фенотип. Во время перепрограммирования для генерации iPS-клеток N-кадгерин может заменять функцию E-кадгерина. Эти функции кадгеринов не связаны напрямую с адгезией, поскольку морфология сфер помогает поддерживать «стволовость» стволовых клеток. Более того, образование сфер из-за принудительного роста клеток на низкой поверхности прикрепления иногда вызывает репрограммирование. Например, нейральные клетки-предшественники могут быть получены из фибробластов напрямую с помощью физического подхода без введения экзогенных факторов репрограммирования.
Физические сигналы в виде параллельных микроканавок на поверхности клеточно-адгезионных субстратов могут заменить эффекты низкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность репрограммирования. Механизм основан на механомодуляции эпигенетического состояния клеток. В частности, «снижение активности гистондеацетилазы и усиление экспрессии домена 5 повторов WD (WDR5) - субъединицы H3-метилтранферазы - с помощью микроканавок на поверхности приводит к усилению ацетилирования и метилирования гистона H3». Нанофиброзные каркасы с выровненной ориентацией волокон производят эффекты, аналогичные тем, которые производятся микроканавками, предполагая, что изменения в морфологии клеток могут быть ответственны за модуляцию эпигенетического состояния.
Роль клеточных адгезий в нервном развитии. Изображение любезно предоставлено пользователем Википедии JWSchmidt под лицензией GNU Free Documentation License Жесткость субстрата - важный биофизический сигнал, влияющий на нейронную индукцию и спецификацию подтипа. Например, мягкие субстраты способствуют нейроэпителиальному преобразованию, ингибируя дифференцировку нервного гребня чЭСК BMP4 -зависимым образом. Механистические исследования выявили многоцелевой механотрансдуктивный процесс, включающий механочувствительное Smad фосфорилирование и ядерно-цитоплазматическое перемещение, регулируемое зависимыми от жесткости Hippo / YAP активностями и актомиозин цитоскелет целостность и сократимость.
эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) подвергаются самообновлению в присутствии цитокина фактор ингибирования лейкемии (LIF). После удаления LIF, mESCs дифференцируются, что сопровождается увеличением адгезии клетка-субстрат и разрастанием клеток. Ограниченное распространение клеток в отсутствие LIF либо путем культивирования мЭСК на химически определенных, слабоадгезионных биосубстратах, либо путем манипулирования цитоскелетом позволяло клеткам оставаться в недифференцированном и плюрипотентном состоянии. Эффект ограниченного распространения клеток на самообновление mESC не опосредован повышенной межклеточной адгезией, поскольку ингибирование адгезии mESC с использованием блокирующего функцию антитела против E-кадгерина или siRNA не способствует дифференцировке. Описаны возможные механизмы предопределения судьбы стволовых клеток посредством физического взаимодействия с внеклеточным матриксом.
Был разработан новый метод, который быстрее и эффективнее превращает клетки в стволовые клетки, «сжимая» их с помощью жесткости трехмерного микроокружения и плотность окружающего геля. Этот метод может быть применен к большому количеству клеток для производства стволовых клеток для медицинских целей в промышленных масштабах.
Клетки, участвующие в процессе репрограммирования, изменяются морфологически по мере продвижения процесса. Это приводит к физическим различиям в силах адгезии между клетками. Существенные различия в «адгезивной сигнатуре» между плюрипотентными стволовыми клетками, частично перепрограммированными клетками, дифференцированным потомством и соматическими клетками позволили разработать процесс разделения для выделения плюрипотентных стволовых клеток в микрофлюидных устройствах, который:
Стволовые клетки обладают механической памятью (они помнят прошлые физические сигналы) - с факторами сигнального пути Hippo : Да-ассоциированный белок (YAP) и коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим доменом (TAZ), действующий как внутриклеточный механический реостат - который хранит информацию из прошлых физических сред и влияет на судьбу клеток.
Инсульт и человек y нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, нуждаются в клеточной заместительной терапии. Успешное использование преобразованных нервных клеток (CN) в трансплантации открывает новые возможности для лечения таких заболеваний. Тем не менее индуцированные нейроны (iNs), непосредственно преобразованные из фибробластов, окончательно коммитируются и проявляют очень ограниченную пролиферативную способность, которая может не обеспечивать достаточное количество аутологичных донорских клеток для трансплантации. Самовосстанавливающиеся индуцированные нейральные стволовые клетки (iNSC) обеспечивают дополнительные преимущества перед iN как для фундаментальных исследований, так и для клинических приложений.
Например, при определенных условиях роста фибробласты мыши можно перепрограммировать с помощью одного фактора Sox2, чтобы образуют iNSC, которые самообновляются в культуре и после трансплантации, могут выжить и интегрироваться, не образуя опухолей в мозге мышей. INSC могут быть получены из фибробластов взрослого человека невирусными методами, таким образом предлагая безопасный метод аутологичной трансплантации или для разработки клеточных моделей заболеваний.
Могут быть созданы нейронные химически индуцированные клетки-предшественники (ciNPC) из фибробластов кончика хвоста мыши и соматических клеток мочи человека без введения экзогенных факторов, но - с помощью химического коктейля, а именно VCR (V, VPA, ингибитор HDAC ; C, CHIR99021, ингибитор киназ GSK-3 и R, RepSox, ингибитор путей передачи сигналов бета TGF ), в физиологическом состоянии гипоксии. Альтернативные коктейли с ингибиторами деацетилирования гистонов, киназы гликогенсинтазы и путей TGF-β (где: бутират натрия (NaB) или трихостатин A (TSA) могут заменить VPA, литий хлорид (LiCl) или карбонат лития (Li2CO3) могут заменять CHIR99021, или Repsox может быть заменен на SB-431542 или Траниласт ) демонстрируют аналогичную эффективность для индукции ciNPC. Zhang и др. Также сообщают об высокоэффективном перепрограммировании фибробластов мыши в индуцированные нейральные стволовые клетки, подобные клеткам (ciNSLC), с использованием смеси из девяти компонентов.
Описано множество методов прямой трансформации соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки.
Доказательство принципиальных экспериментов демонстрирует, что возможно преобразование трансплантированных человеческих фибробластов и человеческих астроцитов непосредственно в головном мозге, которые сконструированы для экспрессии индуцируемых форм нейронных генов репрограммирования, в нейроны, когда репрограммирующие гены (Ascl1, Brn2a и) активируются после трансплантации с использованием лекарственного средства.
Астроциты - наиболее распространенные нейроглиальные клетки мозга, которые способствуют образованию рубцов в ответ на травму - могут быть напрямую перепрограммированы in vivo, чтобы стать функциональными нейронами, которые формируют сети у мышей без трансплантации клеток. Исследователи наблюдали за мышами в течение почти года, чтобы найти признаки образования опухоли, и не обнаружили их. Те же исследователи превратили образующие рубцы астроциты в клетки-предшественники, называемые нейробластами, которые регенерировали в нейроны в поврежденном спинном мозге взрослого человека.
Без миелина для изоляции нейроны, нервные сигналы быстро теряют силу. Заболевания, поражающие миелин, такие как рассеянный склероз, приводят к появлению нервных сигналов, которые не могут распространяться на нервные окончания, и, как следствие, приводят к когнитивным, двигательным и сенсорным проблемам. Трансплантация олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC), которые могут успешно создавать миелиновые оболочки вокруг нервных клеток, является многообещающим потенциальным терапевтическим ответом. Прямое клональное преобразование фибробластов мыши и крысы в олигодендроглиальные клетки является потенциальным источником OPCs. Конверсия путем принудительной экспрессии восьми или трех факторов транскрипции Sox10, Olig2 и Zfp536 может давать такие клетки.
Клеточная терапия in vivo может обеспечить трансформирующий подход к увеличению роста сосудов и мышц и для предотвращения образования неконтрактильных рубцов путем доставки факторов транскрипции или микроРНК к сердцу. Сердечные фибробласты, которые составляют 50% клеток сердца млекопитающих, могут быть перепрограммированы в кардиомиоцитные -подобные клетки in vivo путем локальной доставки факторов транскрипции сердечного ядра (GATA4, MEF2C, TBX5 и для улучшенного перепрограммирования плюс ESRRG, MESP1, Myocardin и ZFPM2) после коронарного лигирования. Эти результаты касались методов лечения, которые могут напрямую ремускуляризовать сердце без трансплантации клеток. Однако эффективность такого репрограммирования оказалась очень низкой, а фенотип полученных кардиомиоцитоподобных клеток не похож на фенотип зрелого нормального кардиомиоцита. Кроме того, трансплантация факторов сердечной транскрипции в поврежденные сердца мышей привела к плохому выживанию клеток и минимальной экспрессии сердечных генов.
Между тем произошел прогресс в способах получения сердечных миоцитов in vitro. Эффективная сердечная дифференцировка iPS-клеток человека привела к появлению предшественников, которые оставались в инфарктных сердцах крыс, и уменьшила ремоделирование сердца после ишемического повреждения.
Группа ученых, возглавляемая Шэн Дином, использовала коктейль из девять химических веществ (9C) для трансдифференцировки клеток кожи человека в бьющиеся клетки сердца. При использовании этого метода более 97% клеток начали биться, что характерно для полностью развитых здоровых сердечных клеток. Химически индуцированные кардиомиоцитоподобные клетки (ciCM) равномерно сокращались и напоминали человеческие кардиомиоциты по своим транскриптомным, эпигенетическим и электрофизиологическим свойствам. При трансплантации в инфарктное сердце мыши фибробласты, обработанные 9C, эффективно превращались в ciCM и развивались в здоровые на вид клетки сердечной мышцы внутри органа. Этот подход химического перепрограммирования после дальнейшей оптимизации может предложить простой способ предоставить сигналы, которые побуждают сердечную мышцу к локальной регенерации.
В другом исследовании была обнаружена ишемическая кардиомиопатия на модели инфаркта мыши. нацелены на трансплантацию iPS-клеток. Он синхронизировал отказавшие желудочки, предлагая регенеративную стратегию для достижения ресинхронизации и защиты от декомпенсации за счет улучшения проводимости и сократимости левого желудочка, уменьшения рубцевания и отмены структурного ремоделирования. Один протокол генерировал популяции до 98% кардиомиоцитов из чПСК просто путем модуляции канонического сигнального пути Wnt в определенные моменты времени во время дифференцировки с использованием легкодоступных низкомолекулярных соединений.
Открытие механизмы, контролирующие образование кардиомиоцитов, привели к разработке препарата ITD-1, который эффективно очищает клеточную поверхность от рецептора TGF-β типа II и избирательно ингибирует внутриклеточную передачу сигналов TGF-β. Таким образом, он избирательно усиливает дифференцировку незарегистрированной мезодермы в кардиомиоциты, но не в гладкие мышцы сосудов и эндотелиальные клетки.
В одном проекте засевали децеллюляризованные сердца мыши мультипотенциальными клетками-предшественниками сердечно-сосудистой системы, полученными с помощью ИПСК человека. Введенные клетки мигрировали, пролиферировали и дифференцировались in situ в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки, чтобы реконструировать сердца. Кроме того, внеклеточный матрикс сердца (субстрат сердечного каркаса) дал сигнал человеческим клеткам стать специализированными клетками, необходимыми для правильной работы сердца. После 20 дней перфузии факторами роста сконструированные ткани сердца снова начали биться и стали реагировать на лекарства.
Перепрограммирование сердечных фибробластов в индуцированные кардиомиоцитоподобные клетки (iCMs) in situ представляет собой многообещающую стратегию сердечной регенерация. Мыши подвергались in vivo воздействию трех факторов сердечной транскрипции GMT (Gata4, Mef2c, Tbx5) и малых молекул: SB-431542 (ингибитор трансформирующего фактора роста (TGF) -β) и XAV939 ( Ингибитор WNT) в течение 2 недель после инфаркта миокарда показал значительно улучшенное репрограммирование (эффективность перепрограммирования увеличилась в восемь раз) и сердечную функцию по сравнению с теми, кто подвергался воздействию только GMT.
См. Также: обзор
Пожилые люди часто страдают прогрессирующей мышечной слабостью и регенеративной недостаточностью, отчасти из-за повышенной активности пути p38α и p38β митоген-активируемой киназы в стареющие стволовые клетки скелетных мышц. Подвергая такие стволовые клетки временному ингибированию p38α и p38β в сочетании с культивированием на мягких субстратах гидрогеля, они быстро размножаются и омолаживаются, что приводит к возвращению их силы.
У гериатрических мышей в состоянии покоя сателлитные клетки теряют обратимое состояние покоя, переходя в необратимое состояние предварительного старения, вызванное дерепрессией p16 INK4a (также называемого Cdkn2a). При травме эти клетки не активируются и не расширяются даже в молодой среде. Подавление p16INK4a в гериатрических сателлитных клетках восстанавливает состояние покоя и регенеративные функции мышц.
Миогенные предшественники для потенциального использования в моделировании заболеваний или клеточной терапии, нацеленной на скелетные мышцы, также могут быть получены непосредственно из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием свободных -плавающая сферическая культура (сферы EZ) в культуральной среде с добавлением высоких концентраций (100 нг / мл) фактора роста фибробластов-2 (FGF-2 ) и эпидермального фактора роста.
В отличие от существующих протоколов получения гепатоцитов из человеческих фибробластов, Saiyong Zhu et al., (2014) не генерировали ИПСК, но, используя небольшие молекулы, прервали перепрограммирование до плюрипотентности генерируют индуцированное состояние мультипотентных клеток-предшественников (iMPC), из которого клетки-предшественники энтодермы и впоследствии гепатоциты (iMPC-Heps) эффективно дифференцируются. После трансплантации иммунодефицитной мышиной модели печеночной недостаточности человека iMPC-Heps интенсивно пролиферировал и приобрел уровни функции гепатоцитов, сходные с таковыми у первичных взрослых гепатоцитов человека. iMPC-Heps необразовывал опухолей, скорее всего, потому что они никогда не переходили в плюрипотентное состояние.
Кишечный крипта - доступный и обильный источник кишечных эпителиальных клеток для преобразования в β-подобных клетки. Эти результаты подтверждают возможность репопуляции печени мышей с человеческими гепатоцитами, созданными in vitro, что устраняет длительное постоянное препятствие на пути к аутологичной терапии печени.
Коктейль из малых молекул, Y-27632, A-83-01 (ингибитор TGFβ киназы / рецептора активина, подобный киназе (ALK5 )) и CHIR99021 (мощный ингибитор GSK-3 ), может превращать зрелые гепатоциты крысы и мыши in vitro в пролиферативные бипотентные клетки - CLiP (химически индуцированные предшественники печени). CLiP могут дифференцироваться как в зрелые гепатоциты, так и в билиарные эпителиальные клетки, которые могут образовывать функциональные протоковые структуры. При длительном культивировании CLiP не утратили пролиферативной способности и способности к дифференцировке печени и повторно заселять хронически поврежденную ткань печени.
Осложнения сахарного диабета, такие как сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатия, невропатия, нефропатия и заболевания периферического кровообращения, зависят от нарушения регуляции сахара из-за недостатка инсулина в бета-клетках поджелудочной железы и может привести к летальному исходу, если их не лечить. Одним из многообещающих подходов к пониманию и лечению диабета является использование плюрипотентных стволовых клеток (PSC), включая эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные PCS (iPSC). К сожалению, инсулин-экспрессирующие клетки, полученные из PSC человека, напоминают β-клетки плода человека, а не β-клетки взрослых. В отличие от β-клеток, β-клетки плода кажутся функционально незрелыми, указывает на повышенную базальная секреция глюкозы и отсутствие стимуляции глюкозы, что подтверждено RNA-seq чьи транскрипты.
Альтернативной стратегией является превращение фибробластов в различные популяции энтодермальных клеток-предшественников и с использованием комбинации сигнальных факторов, успешная дифференцировка этих энтодермальных клеток-предшественников в функциональных бета-клетках как in vitro, так и in vivo.
Сверхэкспрессия трех факторов транскрипции, PDX1 (требуется для разрастания зачатка поджелудочной железы и созревания бета-клеток), NGN3 (требуется для образования эндокринных клеток-предшественников) и MAFA (для созревания бета-клеток) комбинация (называемая PNM) может привести к трансформации некоторых клеток, переходят в состояние, подобное бета-клеткам. Доступным и обильным устройством функциональных клеток, продуцирующих инсулин, является кишечник. Экспрессия PMN в кишечных «органоидах » стимулирует превращение кишечных эпителиальных клеток в β-подобные клетки, возможно, приемлемые для трансплантации.
Взрослые клетки проксимальных канальцев непосредственно транскрипционно репрограммированы в нефрон предшественники эмбриональной почки с использованием шести генов инструктивных факторов транскрипции (SIX1, SIX2, OSR1, глаза отсутствуют, гомолог 1 (EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) и гомолог 2 Snail (SNAI2)), которые активировали гены, соответствующие фенотипу мезенхимы / предшественника кэп-нефрона в клеточной линии проксимальных канальцев взрослых. Генерация таких клеток может привести к клеточной терапии почечной болезни у взрослых. Органоиды эмбриональных почек, помещенные в почки взрослых крыс, могут претерпевать дальнейшее развитие и развитие сосудов.
По мере старения кровеносных сосудов они часто становятся аномальными по структуре и функциям, что способствует их возрасту -ассоциированные заболевания, включая инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, кровоснабжающих сердце, мозг и нижние конечности. Итак, важная цель - стимулировать рост сосудов для коллатерального кровообращения, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Индуцированные сосудистые клетки-предшественники (iVPC) полезны для использования для стимуляции роста коронарных коллатералей. Они были созданы путем частичного перепрограммирования эндотелиальных клеток. Сосудистая приверженность iVPCs связана с эпигенетической памятью эндотелиальных клеток, порождает их как клеточные компоненты растущих кровеносных сосудов. Вот почему, когда iVPC были имплантированы в миокард, они прижились в кровеносных сосудах и увеличили коронарный коллатеральный кровоток лучше, чем ИПСК, мезенхимальные стволовые клетки или нативные эндотелиальные клетки.
Генетическая модификация ex vivo. может быть эффективной стратегией для улучшения функций стволовых клеток. Например, клеточная терапия с использованием генетической модификации киназой Pim-1 (нижестоящий эффектор Akt, который положительно регулирует неоваскулогенез) клеток, полученных из костного мозга, или клетки- Предшественники сердца человека, выделенные из поврежденного миокарда, обеспечивают долговечность восстановления вместе с улучшением функциональных параметров гемодинамики миокарда.
Стволовые клетки, извлеченные из жировой ткани после липосакции, могут стать предшественниками гладкомышечных клеток (iPVSMC), обнаруженных в артериях и венах.
Система 2D-культивирования iPS-клеток человека в сочетании с тройной маркерной селекцией (CD34 (поверхностный гликофосфопротеин, экспрессируемый на фибробластах ранних эмбриональных клеток), NP1 (рецептор - нейропилин 1) и KDR (рецептор, предоставленный домен киназнойки) для выделения васкулогенных клеток-предшественников из ИПСК человека генерировал эндотелиальные клетки, которые после трансплантации образовывали стабильные функциональные вставки кровеносных сосудов мыши in vivo, сохраняющиеся в течение 280 дней.
Для лечения инфаркта важно предотвратить образование фиброзной рубцовой ткани. Этого можно достичь in vivo путем временного применения паракринных факторов, которые перенаправляют вклад нативных стволовых клеток-предшественников сердца из рубцовой ткани в сердечно-сосудистую ткань. Например, в модели инфаркта миокарда у мышей однократная внутримиокардиальная инъекция мРНК фактора роста эндотелия сосудов A человека (VEGF-A modRNA), модифицированная для выхода из нормальной системы защиты организма, приводит к долгосрочному улучшению функции сердца за счет мобилизации и перенаправления эпикардиальных клеток -предшественников к типам сердечно-сосудистых клеток.
RBC переливание необходимо для многих пациентов. Однако на сегодняшний день предложение эритроцитов остается нестабильным. Кроме того, при переливании существует риск передачи инфекционных заболеваний. Большой запас безопасных эритроцитов, созданных in vitro, поможет решить эту проблему. Генерация эритроидных клеток ex vivo может альтернативные продукты для переливания для удовлетворения настоящих и будущих требований. Эритроциты (RBC), полученные in vitro из мобилизованных CD34 положительных клеток, имеют нормальную выживаемость при переливании аутологичному реципиенту. RBC, полученный in vitro, содержит исключительно гемоглобин плода (HbF), что восстанавливает функциональность этих RBC. In vivo переключилось эмбрионального гемоглобина на взрослый наблюдалось после инфузии ядерных предшественников эритроидных, полученных из ИПСК. Эритроциты не имеют ядер и опухолей, следовательно, не имеют образования, их непосредственные предшественники эритробластов имеют ядра. Окончание созревания эритробластов в функциональных эритроцитах требует сложного процесса ремоделирования, который заканчивается экструзией ядра и образования энуклеированных эритроцитов. Репрограммирование клеток часто нарушает энуклеацию. Переливание эритроцитов или эритробластов, созданных in vitro, защищает от образования опухоли.
Путь арил углеводородного фактора (AhR) (который, как было показано, стимулирует развитие раковых клеток) играет важную роль в нормальном развитии крови клеток. Активация AhR в гематопоэтических клетках-предшественниках (HP) вызывает беспрецедентную экспансию HP, мегакариоцитных и эритроидных клеток. См. Также Краткий обзор: Ген SH2B3 кодирует негативный регулятор передачи сигналов цитокинов, и в этом гене увеличивается количество эритроцитов in vivo. Нацеленное подавление SH2B3 в первичных гемопоэтических стволовых клетках человека и клетках-предшественниках увеличивало созревание и общий выход эритроцитов, полученных in vitro. Более того, инактивация SH2B3 путем редактирования генома CRISPR / Cas9 в плюрипотентных стволовых клетках человека позволила увеличить экспансию эритроидных клеток с сохраненной дифференцировкой. (См. Также обзор.)
Тромбоциты, выдавленные из мегакариоцитов Тромбоциты предотвращают кровотечение у пациентов с тромбоцитопенией и пациентов с тромбоцитемией. Существенной проблемой для пациентов с использованием переливаний крови является рефрактерность к переливанию тромбоцитов. Таким образом, способность генерировать продукты тромбоцитов ex vivo и продукты тромбоцитов, лишенные HLA-антигенов в бессывороточной среде, будет иметь клиническое значение. Механизм на основе РНК-интерференции использовал лентивирусный вектор для экспрессии короткошпилочной РНКи, нацеленной на транскрипты β2-микроглобулина в CD34-положительных клетках. Генерированные тромбоциты обладают 85% снижением антигенов HLA класса I. Эти тромбоциты, по-видимому, обладают нормальной функцией in vitro
Одна клиническая стратегия достижения функциональных тромбоцитов из ИПСК человека включает создание стабильных иммортализованных линий клеток-предшественников мегакариоцитов (imMKCL).) с помощью доксициклина -зависимая сверхэкспрессия BMI1 и BCL-XL. Полученные imMKCL могут быть увеличены в культуре в течение продолжительных периодов времени (4–5 месяцев), даже после криоконсервации. Прекращение сверхэкспрессии (путем удаления доксициклина из среды) c-MYC, BMI1 и BCL-XL в растущих imMKCLs привело к продукции CD42b + тромбоциты с функциональностью, сравнимой с функциональностью нативных тромбоцитов на основе ряда анализов in vitro и in vivo. Томас и др. Описывают стратегию прямого программирования, основанную на одновременной экзогенной экспрессии 3 фактора транскрипции: GATA1, FLI1 и TAL1. Запрограммированные вперед мегакариоциты пролиферируют и дифференцируют в культуре в течение нескольких месяцев с чистотой мегакариоцитов более 90%, достигая до 2х10 зрелых мегакариоцитов на входной hPSC. Функциональные тромбоциты генерируются по всей культуре, что позволяет предполагать сбор нескольких трансфузий всего одного миллиона исходных ВПСК. См. Также обзор
Специализированный тип белых кровяных телец, известный как цитотоксические Т лимфоциты (CTL), являются продуцируются иммунной системой и способны распознавать специфические маркеры на поверхности различных инфекционных или опухолевых клеток, заставляя их атаковать вредоносные клетки. Таким образом, иммунотерапия функциональными антиген-специфическими Т-клетками имеет потенциал в качестве терапевтической стратегии для борьбы со многими видами рака и вирусных инфекций. Однако источники клеток ограничены, поскольку они производятся в небольших количествах естественным путем и имеют короткий срок службы.
Потенциально эффективным подходом к созданию антиген-специфичных CTL является превращение зрелых иммунных Т-клеток в ИПСК, которые обладают неопределенной пролиферативной способностью in vitro и после их размножения, чтобы заставить их снова дифференцироваться обратно в Т-клетки.
Другой метод объединяет технологии ИПСК и рецептора химерного антигена (CAR) для создания человеческих Т-клеток, нацеленных на CD19, антиген, экспрессируемый злокачественными В-клетками, в культуре тканей. Этот подход к созданию терапевтических Т-клеток человека может быть полезен для иммунотерапии рака и других медицинских приложений.
Инвариантные естественные клетки-киллеры T (iNKT) обладают большим клиническим потенциалом в качестве адъювантов для иммунотерапии рака. Клетки iNKT действуют как врожденные Т-лимфоциты и служат мостом между врожденной и приобретенной иммунной системой. Они усиливают противоопухолевый ответ за счет продукции гамма-интерферона (IFN-γ). Подход сбора, перепрограммирования / дедифференцировки, повторной дифференцировки и инъекции был предложен для лечения родственных опухолей.
Дендритные клетки (DC) специализируются на контроле Т-клеточных ответов. DC с соответствующими генетическими модификациями могут выжить достаточно долго, чтобы стимулировать антиген-специфические CTL, а после этого полностью элиминироваться. DC-подобные антигенпрезентирующие клетки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, могут служить источником для вакцинационной терапии.
CCAAT / связывающий энхансер белок-α (C / EBPα) индуцирует трансдифференцировку В-клетки в макрофаги с высокой эффективностью и усиливает репрограммирование в iPS-клетки при совместной экспрессии с факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и Myc. с 100-кратным увеличением эффективности репрограммирования iPS-клеток с вовлечением 95% популяции. Кроме того, C / EBPa может с высокой эффективностью превращать выбранные линии клеток В-клеточной лимфомы и лейкемии человека в макрофагоподобные клетки, нарушая способность клеток образовывать опухоли.
вилочковая железа - это первый орган, разрушающийся с возрастом. Это сокращение - одна из основных причин, по которой иммунная система с возрастом становится менее эффективной. Снижение экспрессии эпителиальных клеток тимуса фактора транскрипции FOXN1 было задействовано как компонент механизма, регулирующего возрастную инволюцию.
Клэр Блэкберн и коллеги показали, что это установлено связанная с возрастом инволюция тимуса может быть обращена принудительно путем принудительной активации только одного фактора транскрипции - FOXN1 в эпителиальных клетках тимуса, чтобы способствовать омоложению, пролиферации и дифференцировке этих клеток в полностью функциональный эпителий тимуса. Это омоложение и повышенная пролиферация сопровождались активацией генов, которые способствуют прогрессированию клеточного цикла (циклин D1, ΔN p63, FgfR2IIIb ) и которые необходимы эпителиальным клеткам тимуса для стимулирования определенных аспектов развития Т-клеток (Dll4, Kitl, Ccl25, Cxcl12, Cd40, Cd80, Ctsl, Pax1 ). В будущем этот метод может широко использоваться для усиления иммунной функции и борьбы с воспалением у пациентов путем омоложения тимуса in situ.
Мезенхимальные стволовые / стромальные клетки (МСК) изучаются для применения при восстановлении сердца, почек, нервов, суставов и костей, а также при воспалительных заболеваниях и гемопоэтической котрансплантации. Это связано с их иммуносупрессивными свойствами и способностью дифференцироваться в широкий спектр тканей мезенхимального происхождения. МСК обычно получают из костного мозга или жира взрослых, но для этого требуются болезненные инвазивные процедуры и являются низкочастотными источниками, составляющими всего 0,001–0,01% клеток костного мозга и 0,05% аспиратов липосакции. Что касается аутологичного использования, особенно у пожилых людей, наиболее нуждающихся в восстановлении тканей, качество и качество МСК снижается с возрастом.
IPSC могут быть получены путем омоложения клеток даже долгожителей. ИПСК можно собирать без этических ограничений, а культуру можно бесконечно расширять, они являются выгодным предложением МСК. Обработка IPSC SB-431542 приводит к быстрой и однородной генерации MSC из человеческих iPSC. (SB-431542 является ингибитором путей активина / TGF-, блокируя фосфорилирование рецепторов ALK4, ALK5 и ALK7.) ИПС-МСК могут не обладать способностью к образованию тератом, иметь нормальный стабильный кариотип в культуре и дифференцировки, которые очень похожи на характеристики первичных МСК. Он имеет потенциал для увеличения масштабов in vitro, что позволяет использовать терапию на основе МСК. МСК, механизмы из ИПСК, обладают способностью устройств регенерации пародонта и являются многообещающим средством легкодоступных стволовых клеток для использования в клиническом лечении пародонтита.
Лай и др. И Лу сообщают о химическом методе создания МСК. -подобные клетки (iMSC) из первичных дермальных фибробластов человека с использованием шести химических ингибиторов (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 и CHIR99021) с 3 факторами роста или без них (формирующий фактор роста-транс-β (TGF-β), фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор ингибирования лейкемии (LIF)). Химический коктейль напрямую превращает человеческие фибробласты в iMSC с помощью монослойной культуры за 6 дней, и степень конверсии составила примерно 38%.
Помимо клеточной терапии in vivo, культуру мезенхимальных стволовых клеток человека можно использовать in vitro. для массового производства экзосом, которые являются идеальными носителями для доставки лекарств.
Жировая ткань из-за ее обилия и относительно менее инвазивных методов сбора представляет собой источник мезенхимальных стволовых клеток (МСК). К сожалению, аспираты липосакции содержат только 0,05% МСК. Однако большое количество зрелых адипоцитов, которые в целом утратили свою пролиферативную способность и поэтому обычно выбрасываются, можно легко увеличить нагрузку на клетки и дедифференцироваться в свободные от липидов фибробластоподобные клетки, названные дедифференцированные клетки клеток (DFAT). Клетки DFAT восстанавливают способность к активной пролиферации и проявляют мультипотентные способности. По сравнению со взрослыми стволовыми клетками клетки DFAT демонстрирует уникальные преимущества изобилии, изолированности и однородности. При надлежащей индукционной культуре in vitro или надлежащей среде in vivo клетки DFAT могут демонстрировать адипогенный, остеогенный, хондрогенный и миогенный потенциалы. Они также могут проявлять периваскулярные характеристики и вызывать неоваскуляризацию.
Хрящ - это соединительная ткань, отвечающая за движение суставов без трения. Его дегенерация в конечном итоге приводит к полной потере функции сустава на поздних стадиях остеоартрита. Как бессосудистая и гипоцеллюлярная ткань хрящ имеет ограниченную способность к самовосстановлению. Хондроциты являются единственным типом клеток хряща, в котором они окружены внеклеточным матриксом, который они секретируют и собирают.
Один из методов получения хряща - индуцировать его из iPS-клеток. В качестве альтернативы можно напрямую преобразовать фибробласты в индуцированные хондрогенные клетки (iChon) без промежуточной стадии iPS-клеток, вставив три фактора репрограммирования (c-MYC, KLF4 и SOX9). Клетки iChon человека экспрессировали гены-маркеры хондроцитов (коллаген типа II), но не фибробластов.
Имплантированные в дефекты суставного хряща крыс, клетки iChon человека выживали, образуя хрящевую ткань, в течение по крайней мере четырех недель без опухолей. В этом методе используется c-MYC, который, как считается, играет важную роль в онкогенезе, и используется ретровирус для введения факторов репрограммирования, что исключает его неизменное использование в терапии человека.
Наиболее часто используемыми источниками для перепрограммирования являются клетки крови и фибробласты, полученные путем биопсии кожи, но взятие клеток из мочи менее инвазивно. Последний метод не требует биопсии или забора крови. По состоянию на 2013 год стволовые клетки, полученные из мочи, были дифференцированы на эндотелиальные, остеогенные, хондрогенные, адипогенные, скелетные миогенные и нейрогенные линии без образования тератом. Следовательно, их эпигенетическая память приспособлена для репрограммирования в iPS-клетки. Однако в моче появляется небольшое количество клеток, была достигнута только низкая эффективность преобразования и риск бактериального заражения относительно высок.
Еще одним многообещающим источником клеток для репрограммирования являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные из волосяных фолликулов человека.
Происхождение соматических клеток, используемых для перепрограммирования, может влиять на эффективность репрограммирования, функциональные свойства полученных индуцированные стволовые клетки и способность образовывать опухоли.
IPSC сохраняют эпигенетическую память о своей ткани происхождения, что влияет на их способность к дифференцировке. Эта эпигенетическая память не обязательно проявляется на стадии плюрипотентности - ИПСК, полученные из разных тканей, обладают надлежащей морфологией, экспрессируют маркеры плюрипотентности и способны дифференцироваться на три эмбриональных слоя in vitro и in vivo. Однако эта эпигенетическая память может проявляться во время повторной дифференцировки в определенные типы клеток, которым требуются определенные локусы, несущие остаточные эпигенетические метки.
Биологический портал 
Технологический портал 
Медицинский портал  | Викиверситет содержит обучающие ресурсы о Индуцированных стволовых клетках |
