Войти
Колонии iPS-клеток человека. Веретенообразные клетки на заднем плане - это клетки фибробластов мыши. Только те клетки, которые составляют центральную колонию, iPS-клетками человека. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (также известные как iPS клетки или iPSC ) представляют собой тип плюрипотентная стволовая клетка, которая может быть получена непосредственно из соматической клетки. Технология iPSC была впервые предоставлена лабораторией Шинья Яманака в Киото, Япония, которая в 2006 году показала, что внедрение четырех специфических генов (названных Myc, Oct3 / 4, Sox2 и Klf4 ), кодирующие факторы транскрипции, могли преобразовывать соматические клетки в плюрипотентные стволовые клетки. Он был удостоен Нобелевской премии 2012 года вместе с сэром Джоном Гардоном «за открытие того, что зрелые клетки могут быть перепрограммированы, чтобы стать плюрипотентными».
Плюрипотентные стволовые клетки обещают в области восстановительная медицина. Они могут размножаться бесконечно, а также давать начало любому другому типу клеток в организме (например, нейронам, клеткам сердца, поджелудочной железы и печени), они предоставляют собой единый источник клеток, который можно использовать для замены потерянных из-за повреждений. или болезнь.
Наиболее известным типом плюрипотентных стволовых клеток является эмбриональная стволовая клетка. Однако, поскольку генерация эмбриональных стволовых клеток включает разрушение (или, по крайней мере, манипуляции) с эмбрионом на предимплантационной стадии, их использование много споров. Кроме того, поскольку эмбриональные стволовые клетки могут быть получены только из эмбрионов, до сих пор было невозможно создать подходящие для пациента линии эмбриональных стволовых клеток.
ИПМ могут быть созданы из тканей человека, что означает, что у каждого человека может быть своя собственная линия плюрипотентных стволовых клеток. Эти неограниченные запасы аутологичных клеток можно было бы использовать для создания трансплантатов без риска иммунного отторжения. Практические методы используются в персонализированных усилиях по поиску лекарств и пониманию индивидуальной основы болезни.
Яманака назвал ИПСК со строчная буква «i» из-за держателей iPod и других продуктов.
Схема получения индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клеток. (1) Выделить и культивировать донорские клетки. (2) Трансдукция генов, связанных со стволовыми клетками, клетки вирусными векторами. Красные клетки указывают на клетки, экспрессирующие экзогенные гены. (3) Собирают и культивируют клетки в соответствии с культурой ES-клетки, используя митотически инактивированные питающие клетки (светло-серые). (4) Небольшая подгруппа трансфицированных клеток становится iPS-клетками и генерирует ES-подобные колонии. ИПСК обычно получают путем введения конкретных наборов связанных с плюрипотентностью генов или «факторов репрограммирования» в ячейку данного типа. Исходным набором факторов репрограммирования (также называемых факторов Яманака) являются факторы транскрипции Oct4 (Pou5f1), Sox2, cMyc и Клф4. Эта комбинация является наиболее стандартной для использования ИПСК, каждый из факторов может заменить родственными факторами транскрипции, миРНК, небольшими молекулами или даже несвязанными генами, такими как спецификаторы клонов.
Получение ИПСК обычно является медленным и неэффективным процессом, занимающим 1-2 недели для клеток мыши и 3-4 недели для клеток человека, с эффективностью 0,01-0,1%. Однако были достигнуты значительные успехи в повышении эффективности и времени, необходимого для получения ИПСК. После введения факторов репрограммирования клетки начинают формировать колонии, похожие на плюрипотентные стволовые клетки, которые служат на основании их морфологии условий, которые выбирают их рост, или экспрессии поверхностных маркеров или репортерных генов.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки были впервые получены командой Шинья Яманака из Киотского университета, Япония, в 2006 году. Они предположили, что гены, важные для эмбриональной функции стволовых клеток (ESC) могут вызывать эмбриональное состояние взрослых клеток. Они выбрали двадцать четыре гена, ранее идентифицированных как важные в ESC, и использовали ретровирусы для доставки этих генов к фибробластам мыши. Фибробласты сконструированы таким образом, чтобы любые клетки, реактивные ESC-специфический ген, Fbx15, могли быть выделены с использованием селекции антибиотиков.
После доставки всех двух четырех факторов возникли ESC-подобные колонии, которые повторно активировали репортер Fbx15 и смогли размножаться бесконечно. Чтобы идентифицировать гены, необходимые для перепрограммирования, исследователи удаляли по одному фактору из двадцати четырех. С помощью этого процесса они идентифицировали четыре фактора, Oct4, Sox2, cMyc и Klf4, каждый из которых необходим и вместе достаточен для образования ESC-подобных колоний при отборе для реактивации Fbx15.
В июне 2007 года три исследовательские группы, в том числе группа Яманаки, Гарвардского / Калифорнийского университета, Лос-Анджелес и группа из MIT опубликовали исследования, улучшили подход к репрограммированию, привело к появлению ИПСК, неотличимых от ЭСК. В отличие от ИПСК первого поколения, эти ИПСК второго поколения давали жизнеспособных химических мышей и вносили вклад в зародышевую линию мыши, тем самым достигая «золотого стандарта» для плюрипотентных стволовых клеток.
Эти ИПСК второго поколения получены из фибробластов мыши путем опосредованной ретровирусной экспрессии тех же четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, cMyc, Klf4). Однако вместо использования Fbx15 для отбора плюрипотентных клеток исследователи использовали Nanog, который функционально важен для ESC. Используя эту стратегию, исследователи создали ИПСК, которые были функционально идентичны ЭСК.
Перепрограммирование человеческих клеток в ИПСК было объявлено в ноябре 2007 года двумя независимыми исследовательскими группами: Шинья Яманака из Университета Киото, Япония, который впервые применил оригинальный метод iPSC, и Джеймс Томсон из Университета Висконсин-Мэдисон. кто первым получил эмбриональные стволовые клетки человека. Используя тот же принцип, что и при репрограммировании мышей, группа Яманака успешно трансформировала человеческие фибробласты в ИПСК с теми же четырьмя генами, Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc, используя ретровирусную систему, тогда как Томсон и его коллеги использовали другой набор факторов, Oct4, Sox2, Nanog и Lin28, с использованием лентивирусной системы.
Получение фибробластов для производства ИПСК вовлекает кожу биопсия, и был толчок к выявлению более легкодоступных типов клеток. В 2008 году ИП были получены из кератиноцитов человека, которые можно было получить из одного выщипывания волос. В 2010 году ИПСК были получены из периферических клеток крови, а в 2012 году ИПСК были изготовлены из почечных эпителиальных клеток в моче.
Другие соображения для исходного типа клеток включают мутационную нагрузку (например, клетки могут содержать больше мутации из-за УФ-облучения), время, необходимое для увеличения популяции исходных клеток, и способность дифференцироваться в клетки данного типа.
Генерация ИПСК имеет решающее значение в зависимости от факторов транскрипции, используемых для индукции.
3 октября / 4 и некоторые из семейства генов Sox (Sox1, Sox2, Sox3 и Sox15) были идентифицированы как важные регуляторы транскрипции, участвующие в процессе индукции, отсутствие которых делает индукцию невозможной. Однако дополнительные гены, в том числе некоторые представители семейства Klf (Klf1, Klf2, Klf4 и Klf5), семейства Myc (c-myc, L-myc и N-myc), Nanog и LIN28, как было установлено, для повышения эффективности индукции.
Хотя эти методы, впервые разработанные Яманакой и другими, применили, что взрослые клетки могут быть перепрограммированы в iPS-клетки, все же есть проблемы, связанные с технологией:
В таблице справа суммированы ключевые стратегии и методы, используемые для развития iPS-клеток в первые пять лет после прорыва Яманаки и др. в 2006 г. Строки аналогичных цветов представляют исследования, в которых использовались аналогичные стратегии перепрограммирования.
На этой временной шкале обобщены ключевые стратегии и методы, использованные для разработки iPS-клеток в первые пять лет после прорыва Яманаки и др. В 2006 году. Строки схожих цветов представляют исследования, в которых использовались аналогичные стратегии перепрограммирования. Одна из основных стратегий предотвращения проблем (1) и (2) заключалась в использовании малых молекул, которые могут имитировать эффекты факторов транскрипции. Эти соединения могут компенсировать фактор перепрограммирования, который не действует эффективно на геном или не может перепрограммировать по другой причине; таким образом они повышают эффективность перепрограммирования. Они также избегают проблемы геномной интеграции, которая в некоторых случаях способствует генезу опухоли. Ключевые исследования с использованием такой стратегии были проведены в 2008 году. Melton et al. изучили эффекты гистондеацетилазы (HDAC), ингибитора вальпроевой кислоты. Они обнаружили, что это увеличивает эффективность репрограммирования в 100 раз (по сравнению с традиционным методом Яманаки транскрипционным фактором ). Исследователи предположили, что это соединение имитирует передачу сигналов, которая обычно вызывается фактором транскрипции c-Myc. Механизм компенсации аналогичного типа был предложен для имитации эффектов Sox2. В 2008 году Динг и др. использовали ингибирование гистон-метилтрансферазы (HMT) с помощью BIX-01294 в сочетании с активацией кальциевых каналов в плазматической мембране для повышения эффективности репрограммирования. Deng et al. из Пекинского университета сообщил в июле 2013 года, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть созданы без каких-либо генетических модификаций. Они использовали коктейль из семи низкомолекулярных соединений, включая DZNep, чтобы индуцировать соматические клетки мыши в стволовые клетки, которые они назвали клетками CiPS, с эффективностью - 0,2% - сравнимой с эффективностью при использовании стандартных методов получения ИПСК. Клетки CiPS были введены в развивающиеся мышиные эмбрионы, и было обнаружено, что они вносят вклад во все основные типы клеток, что доказывает их плюрипотентность.
Ding et al. продемонстрировали альтернативу репрограммированию фактора транскрипции с помощью химических веществ, подобных лекарству. Изучая процесс MET (мезенхимально-эпителиальный переход ), в котором фибробласты переводятся в состояние, подобное стволовым клеткам, группа Динга идентифицировала два химических вещества - ингибитор ALK5 SB431412 и ингибитор MEK (митоген-активированная протеинкиназа)PD0325901. - что повышает эффективность классического метода в 100 раз. Добавление третьего соединения, которое, как известно, участвует в процессе выживания клеток, увеличивая эффективность в 200 раз. Использование комбинации этих трех соединений также уменьшило процесс репрограммирования человеческих фибробластов с четырех недель до двух недель.
В апреле 2009 года было установлено, что создание iPS-клеток возможно без каких-либо генетических изменений взрослых клеток: повторной обработки клеток определенными белками, направленными в клетки через полиаргининовые якоря, было достаточно для индукции плюрипотентности. Для этих ИПСК используется аббревиатура piPSC (индуцированные белком плюрипотентные стволовые клетки).
Другой стратегией для предотвращения таких проблем, как генез опухоли и низкая пропускная способность, было использование альтернативных форм векторов: аденовирус, плазмиды, а также голую ДНК и / или белковые соединения.
В 2008 году Hochedlinger et al. использовали аденовирус для переноса необходимых факторов транскрипции в клетках ДНК кожи и печени мышей, в результате чего были получены клетки, идентичные ESC. аденовирус отличается от векторов, таких как вирусы и ретровирусы, потому что он не встраивает какие-либо собственные гены в целевого хозяина и избегает возможности инсерционного мутагенеза. В 2009 году Freed et al. Примерали успешное перепрограммирование человеческих фибробластов в iPS-клетки. Еще одно преимущество использования аденовирусов состоит в том, что они присутствуют только в течение короткого промежутка времени, чтобы произошло эффективное репрограммирование.
Также в 2008 году Яманака и др. чтобы они могли переносить четыре необходимых гена с помощью плазмиды. Группа Яманака успешно перепрограммировала мыши путем трансфекции двумя плазмидными конструкциями, несущими факторами репрограммирования; первая плазмида экспрессировала c-Myc, а вторая - три других фактора (Oct4, Klf4 и Sox2 ). Хотя плазмидные методы избегают вирусов, они все же требуют генов, способствующих развитию рака, для выполнения репрограммирования. Другая проблема - эти методы являются гораздо менее эффективными по сравнению с ретровирусными методами. Кроме того, было показано, что трансфицированные плазмиды интегрируются в геном хозяина и, следовательно, они все еще уменьшают риск инсерционного мутагенеза. Исследователи попытались эффективно спасти эту технику с помощью так называемой транспозонной системы PiggyBac. Несколько методов исследования, которые используются в геноме клетки-хозяина. Система транспозонов PiggyBac включает повторное вырезание экзогенных генов, что устраняет проблему инсерционного мутагенеза.
В январе 2014 г. были опубликованы две статьи, в которых утверждено, что тип плюотентных стволовых клеток можно получить, подвергая клетки определенным типам стресса (бактериальный токсин, низкий pH 5,7 или физическое воздействие); данные клетки названы STAP-клетками для стимулирования стимулирования плюрипотентности.
В свете трудностей, с помощью других лабораторий столкнулись с воспроизведением результатов неожиданного исследования, в марте 2014 года один из соавторовал статьи, которые нужно отозвать. 4 июня 2014 г. ведущий автор, Обоката согласился отозвать обе статьи после того, как было установлено, что она совершила «неправомерное поведение в отношении исследования», как было установлено в ходе расследования, проведенного РИКЕН 1 апреля 2014 г. г..
МикроРНК представляют собой короткие молекулы РНК, которые связываются с комплементарными последовательностями информации РНК и блокируют экспрессию гена. Измерение вариаций экспрессии микроРНК в iPS-клетках можно использовать для прогнозирования их дифференцировки. Добавление микроРНК также может Роман для увеличения предложения ИПС. Было предложено несколько механизмов. Специфичные для ES-клеток молекулы микроРНК (такие как miR-291, miR-294 и miR-295) повышают эффективность индуцированной плюрипотентности, действуя ниже c-Myc. микроРНК также могут блокировать экспрессию репрессоров четырех факторов транскрипции Яманаки, могут вызывать дополнительные механизмы, индуцирующие перепрограммирование даже в отсутствие добавленных экзогенных факторов транскрипции.
Три клетки / зародышевой линии, дифференцированные от ИПСК: нейроны (эктодерма ), хрящ (мягкая кость, мезодерма ) и бокаловидные клетки в кишечнике (энтодерма). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с естественными плюрипотентными стволовыми клетками, такими как эмбриональные стволовые (ES) клетки, во многих проблемах, таких как экспрессия клеток генов и белков стволовых клеток, сходтерны метилирования хроматина, удвоение время, формирование эмбриоидного тела, образование тератомы, образование жизнеспособной химеры, а также эффективность и дифференцируемость, но полная степень их взаимосвязи
Экспрессия генов и H3K4me3 и H3K27me3 в масштабе всего генома и H3K27me3 оказались очень похожими между ES- и iPS-клетками. Сгенерированные ИП были удивительно на естественно выделенные плюрипотентные стволовые клетки (такие как мыши и человеческие эмбриональные стволовые клетки, mESC и hESC соответственно) в следующих отношениях, что подтверждается идентичность, аутентичность и плюрипотентность ИПСК естественно изолированным плюрипотентным стволовым клеткам :
Недавние достижения и будущие задачи для безопасной клеточной терапии на основе ИПСК собраны обзоры Окано и др.
Задача получения iPS-клеток продолжает оставаться сложной из шести проблем, упомянутых выше. Ключевой компромисс, который необходимо преодолеть, - это компромисс между эффективностью и геномной интеграцией. Большинство методов, которые не полагаются на интеграцию трансгенов, неэффективны, в то время, как полагаются на интеграцию трансгенов, сталкиваются с проблемами неполного репрограммирования и генеза опухоли, хотя было предпринято множество попыток и методов. Еще один большой набор стратегий - провести протеомную характеристику iPS-клеток. Дальнейшие исследования и новые стратегии привести к оптимальным решениям пяти основных проблем. Один из подходов может попытаться объединить положительные атрибуты этих технологий в эффективную технику репрограммирования клеток в iPS-клетки.
Другой подход - это использование iPS-клеток, полученных от идентификационных терапевтических препаратов, способных спасти фенотип. Например, линии iPS-клеток, полученных от пациентов, страдающих синдромом эктодермальной дисплазии (EEC), у мутирован ген p63, демонстрируют аномальную эпителиальную приверженность, которую можно частично устранить с помощью небольшого соединения.
Привлекательной особенностью iPS-клеток человека является способность получать их от взрослых для изучения клеточной основы человеческого заболевания. IPS-клетки представляют собой самообновляемые и плюрипотентные клетки, которые представляют собой теоретически неограниченные клетки, представленные пациентом, которые могут превратить клетки любого типа в организм. Это важно, потому что многие другие клетки человека, полученные от пациентов, имеют тенденцию прекращать рост после нескольких пациентов в лабораторной культуре. iPS-клетки были созданы для лечения широкого генетических заболеваний человека, включая общие нарушения, такие как синдром Дауна и поликистоз почек. Во многих случаях наблюдаются случаи патофизиологии. Международный совместный проект StemBANCC основан в 2012 году для создания коллекции линий iPS-клеток для скрининга лекарств для различных заболеваний. Под управлением Оксфордского университета были объединены средства и ресурсы 10 фармацевтических компаний и 23 университетов. Цель состоит в том, чтобы создать из 1500 клеточных линий системы iPS. Кроме того, сочетание технологий hiPSC и генетически закодированных индикаторов напряжения и кальция обеспечило крупномасштабную и высокопроизводительную платформу для скрининга безопасности сердечно-сосудистых препаратов.
Доказательство концепции Исследователи из Японии сообщили об использовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для создания человеческого органа для трансплантации. «печень зачатки» человека (iPSC-LB) выращивали из смесей трех различных типов стволовых клеток: гепатоцитов (для функции печени), коаксиальных с ИПСК; эндотелиальные стволовые клетки (для формирования выстилки кровеносных сосудов ) из пуповинной крови ; и мезенхимальные стволовые клетки (для образования соединительной ткани ). Этот новый подход позволяет различным типам клеток самоорганизовываться в сложный орган, имитируя процесс внутриутробного развития. После выращивания in vitro в течение нескольких дней трансплантировали мышам, где «печень» быстро соединялась с кровеносными сосудами хозяина и продолжала расти. Употребление в пищу специальных белков печени. Дальнейшие исследования будут контролировать долговечность трансплантированного органа в организм хозяина (способность интегрировать или исключить отторжения ) и будет ли он трансформироваться в опухоли. Используя этот метод, клетки одной мыши можно было использовать для тестирования 1000 соединений для лечения заболеваний печени и сокращения использования животных до 50 000.
Эмбриональные клетки пуповинной крови индуцируются в плюрипотентные стволовые клетки с использованием плазмидной ДНК. Используя эндотелиальные / перицитарные маркеры клеточной поверхности CD31 и CD146, исследователи идентифицировали «сосудистых предшественников», высококачественные мультипотентные сосудистые стволовые клетки. После того, как iPS-клетки были введены непосредственно в стекловидное тело поврежденной сетчатки мышей, стволовые клетки прижились в сетчатке, выросли и восстановили сосуды.
. Было показано, что НЧ, полученное из ИПСК, введенные лабораторным животным с поражением головного мозга, мигрируют в очаги исследования, и наблюдаются улучшения двигательной функции.
Бьющиеся клетки сердечной мышцы, полученные из ИПСК кардиомиоциты, могут производиться в массовом порядке с использованием химически определенных протоколов дифференцировки. Эти протоколы обычно модулируют те же пути передачи сигналов, необходимые для развития сердца. Эти iPSC-кардиомиоциты могут воспроизводить генетические аритмии и сердечные лекарственные реакции, поскольку они имеют тот же генетический фон, что и пациент, от которого они были получены.
В июне 2014 года Takara Bio получила технологию передачи от iHeart Japan, венчурной компании Института исследований iPS-клеток в Киотском университете, чтобы сделать возможным использование исключительно технологий и патентов, которые индуцируют дифференцировку iPS-клеток в кардиомиоциты в Азии. Компания объявила об идее продажи кардиомиоцитов фармацевтическим компаниям и университетам, чтобы помочь в разработке новых лекарств от болезней сердца.
9 марта 2018 года Комитет по специальной регенеративной медицине Университета Официально одобрил первый в мире план клинических исследований. трансплантировать «миокардиальный лист» из iPS-клеток в сердце пациента с тяжелой сердечной недостаточностью. Университет Осаки объявил, что в тот же день подал заявку в Министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения.
16 мая 2018 года клинической группы исследований был одобрен группой сообщества здравоохранения, социального обеспечения с условием.
В октябре 2019 года группа в Университете Окаяма разработала модель ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, дифференцированных от iPS-клеток.
Хотя пинта донорской крови содержит около двух триллионов эритроцитов и более 107 миллионов донаций крови собираются во всем мире, по-прежнему существует острая потребность в крови для переливания. В 2014 г. эритроциты типа O были синтезированы в Шотландской национальной службе переливания крови из iPSC. Было индуцировано превращение клеток в мезодерму, затем в клетки крови, а затем в красные кровяные тельца. Последним шагом было выбросить их ядро и должным образом созреть. Тип O можно переливать всем пациентам. Ожидается, что клинические испытания на людях начнутся не раньше 2016 года.
Первое клиническое испытание на людях с использованием аутологичных ИПСК было одобрено Министерства здравоохранения Японии и должно было быть проводиться в 2014 году в Центре биологии развития Рикен в Кобе. Однако судебное разбирательство было приостановлено после того, как в ноябре 2015 года вступили в силу новые законы Японии о регенеративной медицине. В частности, существующий набор руководящих принципов был усилен, чтобы иметь силу закона (ранее - просто рекомендации). ИПСК, полученные из клеток кожи от шести пациентов, страдающих влажной возрастной дегенерацией желтого пятна, были перепрограммированы для дифференциации в клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE). Клеточный лист будет трансплантирован в пораженную сетчатку, где иссекается дегенерированная ткань RPE. Мониторинг безопасности и восстановления зрения должен был длиться от одного до трех лет.
В марте 2017 года группа под руководством Масайо Такахаши завершила первую успешную трансплантацию клеток сетчатки, полученные из iPS, от донора к донору. глаз человека с выраженной дегенерацией желтого пятна. Однако сообщалось, что сейчас у них возникли осложнения. Преимущества использования аутологичных ИПСК заключаются в том, что теоретически отсутствует риск отторжения и что при этом отпадает необходимость в использовании эмбриональных стволовых клеток. Однако эти ИПСК были получены от другого человека.
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, индуцированные в плюрипотентность, имеют большие перспективы для замедления или обращения вспять фенотипов старения. Такие антивозрастные свойства были применены в ранних клинических испытаниях в 2017 году. В 2020 году исследователи Стэнфордского университета пришли к выводу после изучения пожилых мышей, что старые человеческие клетки подвергаются воздействию факторов Яманака.
 | На Wikimedia Commons есть средства массовой информации, связанные с индуцированным плюрипотентным стволовыми клетками. |
