Войти
Обзор рабочего процесса эксперимента ChIP-on-Chip. ChIP-on- чип (также известный как ChIP-chip ) - это технология, сочетающая иммунопреципитацию хроматина ('ChIP') с ДНК-микрочипом («чипом»). Как и обычный ChIP, ChIP-on-chip используется для исследования взаимодействий между белками и ДНК in vivo. В частности, он позволяет идентифицировать цистром, сумму сайтов связывания, для ДНК-связывающих белков на основе всего генома. Анализ всего генома может быть выполнен для определения местоположения сайтов связывания практически для любого интересующего белка. Как следует из названия метода, такие белки, как правило, действуют в контексте хроматина. Наиболее яркими представителями этого класса являются факторы транскрипции, белки, связанные с репликацией, такие как комплекс распознавания ориджина белок (ORC), гистоны, их варианты и модификации гистонов.
Целью ChIP-on-chip является обнаружение сайтов связывания белка, которые могут помочь идентифицировать функциональные элементы в геноме. Например, в случае фактора транскрипции в качестве представляющего интерес белка можно определить сайты связывания его фактора транскрипции по всему геному. Другие белки позволяют идентифицировать промоторные области, энхансеры, репрессоры и элементы сайленсинга, инсуляторы, граничные элементы. и последовательности, контролирующие репликацию ДНК. Если гистоны представляют интерес, считается, что распределение модификаций и их локализация могут предложить новое понимание механизмов регуляции.
Одной из долгосрочных целей, для которой был разработан ChIP-on-chip, является создать каталог (выбранных) организмов, в котором перечислены все взаимодействия белок-ДНК в различных физиологических условиях. Эти знания в конечном итоге помогут понять механизм регуляции генов, пролиферации клеток и прогрессирования заболевания. Следовательно, ChIP-on-Chip предлагает как потенциал для дополнения наших знаний об оркестровке генома на уровне нуклеотидов, так и информацию о более высоких уровнях информации и регуляции, поскольку она распространяется исследованиями эпигенетики.
Технические платформы для проведения ChIP-on- Чип-эксперименты - это ДНК-микрочипы, или «чипы». Их можно классифицировать и различать по различным характеристикам:
Тип зонда: массивы ДНК могут содержать либо механически окрашенные кДНК, либо продукты ПЦР, механические пятна олигонуклеотиды или олигонуклеотиды, которые синтезируются in situ. Ранние версии микрочипов были разработаны для обнаружения РНК из экспрессируемых областей генома (открытых рамок считывания, известных как ORF). Хотя такие наборы идеально подходят для изучения профилей экспрессии генов, они имеют ограниченное значение в экспериментах с ChIP, поскольку наиболее «интересные» белки в отношении этого метода связываются в межгенных областях. В настоящее время даже массивы, изготовленные по индивидуальному заказу, можно проектировать и настраивать в соответствии с требованиями эксперимента. Кроме того, любая последовательность нуклеотидов может быть синтезирована для покрытия как генных, так и межгенных областей.
Размер зонда: ранние версии массивов кДНК имели длину зонда около 200 пар оснований. В последних версиях массивов используются олигонуклеотиды от 70- (Microarrays, Inc.) до 25-меров (Affymetrix ). (Февраль 2007 г.)
Состав зонда: есть мозаичные и не мозаичные массивы ДНК. В не мозаичных массивах используются зонды, выбранные в соответствии с непространственными критериями, то есть последовательности ДНК, используемые в качестве зондов, не имеют фиксированных расстояний в геноме. Однако мозаичные массивы выбирают геномную область (или даже весь геном) и делят ее на равные части. Такой участок называется плиточным путем. Среднее расстояние между каждой парой соседних фрагментов (измеренное от центра каждого фрагмента) дает разрешение мозаичного пути. Путь может быть перекрывающимся, сквозным или разнесенным.
Размер массива: первые микроматрицы, использованные для ChIP-on-Chip, содержали около 13000 пятнистых сегментов ДНК, представляющих все ORF и межгенные области генома дрожжей. В настоящее время Affymetrix предлагает полногеномные мозаичные дрожжевые массивы с разрешением 5 пар оснований (всего 3,2 миллиона зондов). Тайловые массивы человеческого генома тоже становятся все более мощными. Просто чтобы назвать один пример, Affymetrix предлагает набор из семи массивов с примерно 90 миллионами зондов, охватывающих полную неповторяющуюся часть человеческого генома с интервалом около 35 пар оснований. (Февраль 2007 г.) Помимо собственно микрочипа, для проведения экспериментов с чипом на кристалле необходимо другое аппаратное и программное обеспечение. Обычно микроматрицы одной компании не могут быть проанализированы аппаратным обеспечением другой компании. Следовательно, покупка массива требует также покупки соответствующего оборудования для рабочего процесса. Наиболее важными элементами являются, среди прочего, печи для гибридизации, сканеры чипов и пакеты программного обеспечения для последующего численного анализа исходных данных.
Начиная с биологического вопроса, эксперимент с чипом на чипе можно разделить на три основных этапа: Первый - установка и проектирование. эксперимента, выбрав соответствующий массив и тип зонда. Во-вторых, настоящий эксперимент проводится в мокрой лаборатории. Наконец, во время части цикла в сухой лаборатории собранные данные анализируются, чтобы либо ответить на исходный вопрос, либо привести к новым вопросам, чтобы цикл можно было начать заново.
Обзор рабочего процесса части «мокрой лаборатории» эксперимента с чипом на кристалле. На первом этапе интересующий белок (POI) равен сшивается с участком ДНК, с которым он связывается, в среде in vitro. Обычно это достигается путем нежной фиксации формальдегидом, которая обратима при нагревании.
Затем клетки лизируют и ДНК разрезают с помощью обработки ультразвуком или с использованием микрококковой нуклеазы. В результате образуются двухцепочечные куски фрагментов ДНК, обычно длиной 1 т.п.н. или меньше. Те, которые были сшиты с POI, образуют комплекс POI-ДНК.
На следующем этапе только эти комплексы отфильтровываются из набора фрагментов ДНК с использованием антитела, специфичного к POI. Антитела могут быть прикреплены к твердой поверхности, могут иметь магнитный шарик или какое-либо другое физическое свойство, которое позволяет разделять сшитые комплексы и несвязанные фрагменты. Эта процедура по существу представляет собой иммунопреципитацию (IP) белка. Это можно сделать либо с использованием меченого белка с антителом против метки (например, FLAG, HA, c-myc), либо с помощью антитела к нативному белку.
Сшивание комплексов POI-ДНК меняется на противоположное (обычно путем нагревания), и цепи ДНК очищаются. Для остальной части рабочего процесса точка интереса больше не нужна.
После стадии амплификации и денатурации фрагменты одноцепочечной ДНК маркируются флуоресцентной меткой, например Cy5 или Alexa 647.
Наконец, фрагменты выливаются на поверхность микроматрицы ДНК, на которую наносятся короткие одноцепочечные последовательности, покрывающие интересующую геномную часть. Когда меченый фрагмент «находит» комплементарный фрагмент в массиве, он гибридизуется и снова образует двухцепочечный фрагмент ДНК.
Обзор рабочего процесса в части эксперимента с микросхемой на кристалле в сухой лаборатории. По истечении достаточно длительного периода времени, чтобы позволить гибридизацию, массив подсвечивается с люминесцентным светом. Те зонды на матрице, которые гибридизируются с одним из меченых фрагментов, излучают световой сигнал, который фиксируется камерой. Это изображение содержит все необработанные данные для оставшейся части рабочего процесса.
Эти необработанные данные, закодированные как изображение в ложных цветах, необходимо преобразовать в числовые значения, прежде чем можно будет провести фактический анализ. Анализ и извлечение информации из необработанных данных часто остается самой сложной частью экспериментов с чипом на кристалле. Проблемы возникают на протяжении всей этой части рабочего процесса, начиная от начального считывания чипа и заканчивая подходящими методами вычитания фонового шума и, наконец, соответствующими алгоритмами , которые нормализуют данные и делают их доступны для последующего статистического анализа, который, как мы надеемся, приведет к лучшему пониманию биологического вопроса, на решение которого направлен эксперимент. Кроме того, из-за различных платформ массивов и отсутствия стандартизации между ними хранение и обмен данными представляет собой огромную проблему. Вообще говоря, анализ данных можно разделить на три основных этапа:
На первом этапе полученные сигналы флуоресценции от массива нормализуются с использованием сигналов управления, полученных от того же или второго чипа. Такие контрольные сигналы говорят о том, какие зонды на матрице были гибридизованы правильно, а какие - неспецифически.
На втором этапе численные и статистические тесты применяются к контрольным данным и данным фракции IP, чтобы идентифицировать обогащенные POI области вдоль генома. Широко используются следующие три метода:, и. Эти методы обычно различаются тем, как обрабатываются сигналы с низкой интенсивностью, насколько приемлемым является фоновый шум и какие особенности данных выделяются во время вычислений. В недавнем прошлом подход скользящего окна, по-видимому, был предпочтительным и часто описывался как наиболее эффективный.
На третьем этапе эти области анализируются дополнительно. Если, например, POI был фактором транскрипции, такие области представляли бы его сайты связывания. При последующем анализе может потребоваться вывести нуклеотидные мотивы и другие паттерны, чтобы обеспечить функциональную аннотацию генома.
Использование мозаичных массивов, ChIP -on-chip обеспечивает высокое разрешение полногеномных карт. Эти карты могут определять сайты связывания многих ДНК-связывающих белков, таких как факторы транскрипции, а также модификации хроматина.
Хотя использование микросхемы на кристалле может быть мощным методом в области геномики, это очень дорого. Большинство опубликованных исследований с использованием ChIP-on-Chip повторяют свои эксперименты по крайней мере три раза, чтобы получить биологически значимые карты. Стоимость микрочипов ДНК часто является ограничивающим фактором при выборе лаборатории для проведения эксперимента с чипом на чипе. Еще одно ограничение - это размер фрагментов ДНК, который может быть получен. В большинстве протоколов «чип на чипе» обработка ультразвуком используется как метод разделения ДНК на мелкие кусочки. Однако обработка ультразвуком ограничена минимальным размером фрагмента 200 п.н. Для карт с более высоким разрешением это ограничение должно быть преодолено, чтобы получить более мелкие фрагменты, предпочтительно до разрешения одной нуклеосомы. Как упоминалось ранее, статистический анализ огромного количества данных, сгенерированных из массивов, является сложной задачей, и процедуры нормализации должны быть направлены на минимизацию артефактов и определение того, что действительно является биологически значимым. До сих пор применение к геномам млекопитающих было серьезным ограничением, например, из-за значительного процента генома, занятого повторами. Однако, по мере развития технологии ChIP-on-Chip, карты полного генома млекопитающих с высоким разрешением должны стать доступными.
Антитела, используемые для ChIP -on-chip, могут быть важным ограничивающим фактором. ChIP -on-chip требует высокоспецифичных антител, которые должны распознавать его эпитоп в свободном растворе, а также в фиксированных условиях. Если продемонстрировано успешное иммунопреципитирование перекрестно-сшитого хроматина, это называется «». Компании, которые предоставляют антитела класса ChIP, включают Abcam, Cell Signaling Technology, Santa Cruz и Upstate. Чтобы преодолеть проблему специфичности, интересующий белок можно слить с меткой, подобной FLAG или HA, которые распознаются антителами. Альтернативой ChIP-on-chip, не требующей антител, является DamID.
. Также доступны антитела против специфической модификации гистона, такой как H3 триметил K4. Как упоминалось ранее, комбинация этих антител и ChIP-on-chip стала чрезвычайно мощной при определении полногеномного анализа паттернов модификации гистонов и внесет огромный вклад в наше понимание гистонового кода и эпигенетики.
Исследование, демонстрирующее неспецифическую природу связывающих ДНК белков, было опубликовано в PLoS Biology. Это указывает на то, что альтернативное подтверждение функциональной релевантности является необходимым этапом в любом эксперименте с чипом ChIP.
Первый эксперимент с чипом на чипе был проведен в 1999 году для анализа распределения когезина. вдоль бутона дрожжей хромосомы III. Хотя геном не был полностью представлен, протокол в этом исследовании остается таким же, как и в более поздних исследованиях. Затем метод ChIP-on-chip с использованием всех ORF генома (который, тем не менее, остается неполным, отсутствующими межгенными областями) был успешно применен в трех статьях, опубликованных в 2000 и 2001 годах. Авторы идентифицировали сайты связывания для отдельных факторов транскрипции в почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae. В 2002 году группа Ричарда Янга определила положения 106 транскрипционных факторов по всему геному, используя систему мечения c-Myc у дрожжей. Первая демонстрация метода ChIp-on-Chip у млекопитающих показала, что выделение девяти фрагментов хроматина, содержащих слабый и сильный сайт связывания E2F, было проведено лабораторией Пегги Фарнхэм в сотрудничестве с лабораторией Майкла Чжана и опубликовано в 2001 году. Это исследование было проведено несколько месяцев спустя. в сотрудничестве между лабораторией Янга и лабораторией Брайана Динлахта, которая использовала технику ChIP-on-chip, чтобы впервые показать, что мишени E2F кодируют компоненты контрольной точки повреждения ДНК и пути восстановления, а также факторы, участвующие в сборке хроматина / конденсация, сегрегация хромосом и контрольная точка митотического веретена. Другие применения ChIP-on-chip включают репликацию ДНК, рекомбинацию и структуру хроматина. С тех пор ChIP-on-Chip стал мощным инструментом для определения полногеномных карт модификаций гистонов и многих других факторов транскрипции. ChIP-on-chip в системах млекопитающих было затруднено из-за больших и повторяющихся геномов. Таким образом, многие исследования на клетках млекопитающих были сосредоточены на избранных промоторных областях, которые, как предполагается, связывают факторы транскрипции, и не анализировали весь геном. Однако недавно массивы целых геномов млекопитающих стали коммерчески доступны от таких компаний, как Nimblegen. В будущем, по мере того как массивы ChIP-on-Chip будут становиться все более и более совершенными, карты полного генома с высоким разрешением ДНК-связывающих белков и компонентов хроматина для млекопитающих будут анализироваться более подробно.
Чип-секвенирование - это недавно разработанная технология, в которой до сих пор используется иммунопреципитация хроматина для перекрестного связывания представляющих интерес белков с ДНК, но вместо использования микромассивов используется более точная, более производительный метод секвенирования для локализации точек взаимодействия.
DamID - альтернативный метод, не требующий антител.
ChIP-exo использует обработку экзонуклеазой для достижения разрешения до одной пары оснований.
CUT RUN секвенирование использует распознавание антител с целевым ферментативным расщеплением для устранения некоторых технических ограничений ChIP
