Войти
FLAG-тег, или FLAG октапептид, или FLAG-эпитоп, представляет собой полипептид белковый тег которые могут быть добавлены к белку с использованием технологии рекомбинантной ДНК , имеющей мотив последовательности DYKDDDDK (где D = аспарагиновая кислота, Y = тирозин и K = лизин ). Это один из наиболее специфичных тегов, и это искусственный антиген, к которому были разработаны специфические высокоаффинные моноклональные антитела, и поэтому он может использоваться для очистки белков с помощью аффинной хроматографии, а также может использоваться для определения местонахождения белков. внутри живых клеток. Его использовали для отделения рекомбинантного сверхэкспрессированного белка от белка дикого типа, экспрессируемого организмом-хозяином. Его также можно использовать для выделения белковых комплексов с множеством субъединиц, поскольку его мягкая процедура очистки, как правило, не разрушает такие комплексы. Он был использован для получения белков достаточной чистоты и качества для определения трехмерной структуры с помощью рентгеновской кристаллографии.
. Тег FLAG может использоваться во многих различных анализах, которые требуют распознавания антителом. Если нет антитела против данного белка, добавление тега FLAG к белку позволяет исследовать белок с помощью антитела против последовательности FLAG. Примерами являются исследования клеточной локализации с помощью иммунофлуоресценции, иммунопреципитации или обнаружения с помощью электрофореза белка SDS PAGE и вестерн-блоттинга.
Пептидная последовательность FLAG-метки от N-конца до C-конца: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, его можно использовать в тандеме, обычно с пептидом 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (с последней меткой, кодирующей сайт расщепления энтерокиназой). Он может быть слит с С-концом или N-концом белка или вставлен в белок. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1 / 4E11) распознают эпитоп только тогда, когда он присутствует на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, M2) нечувствительны к положению. Остаток тирозина в теге FLAG может быть сульфатирован, что может влиять на распознавание антителом эпитопа FLAG. Тег FLAG может использоваться вместе с другими тегами аффинности, например, с полигистидиновым тегом (His-tag ), HA-tag или myc-tag.
Первое использование мечения эпитопа было описано Манро и Пелхамом в 1984 году. Тег FLAG был вторым примером полностью функциональной улучшенной метки эпитопа, опубликованным в научной литературе. и был единственной запатентованной меткой эпитопа. С тех пор он стал наиболее часто используемой белковой меткой в лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где моноклональные антитела сначала выделяли против существующего белка, а затем эпитоп характеризовали и использовали в качестве метки, эпитоп FLAG представлял собой идеализированный искусственный дизайн, к которому были выведены моноклональные антитела.. Структура тега FLAG была оптимизирована для совместимости с белками, к которым он прикреплен, в том смысле, что он более гидрофильный, чем другие общие теги эпитопа, и, следовательно, с меньшей вероятностью денатурирует или инактивирует белки, к которым он присоединен. Кроме того, N-концевые теги FLAG можно легко удалить с белков после их выделения путем обработки специфической протеазой, энтерокиназой (энтеропептидазой ).
Третий отчет о маркировке эпитопов (HA-tag ) появился примерно через год после первой поставки системы Flag.
Портал биологии 