Комплементарная ДНК

редактировать
Одноцепочечная ДНК, синтезированная из матрицы РНК под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы

Выход из кДНК микроматрица, используемая в тестировании

В генетике, комплементарная ДНК (кДНК ) - это ДНК, синтезированная из матрица одноцепочечной РНК (например, матричная РНК (мРНК ) или микроРНК (миРНК)) в реакции, катализируемой ферментом обратной транскриптазой. кДНК часто используется для клонирования эукариотических генов в прокариот. Когда ученые хотят экспрессировать определенный белок в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т. Е. гетерологичная экспрессия), они переносят кДНК, которая кодирует для белка в клетку-реципиент. В молекулярной биологии кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в тканях, отдельных клетках или отдельных ядрах в анализах, таких как микроматрицы и RNA-seq.

кДНК. также естественным образом продуцируется ретровирусами (такими как ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирус иммунодефицита обезьян и т. д.), а затем интегрирована в геном хозяина, где он создает провирус.

Термин кДНК также используется, обычно в контексте биоинформатики, для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (GCAT), а не оснований РНК (GCAU).

Содержание

  • 1 Синтез
    • 1.1 Очистка РНК
    • 1.2 Обратная транскрипция
      • 1.2.1 Синтез первой цепи
      • 1.2.2 Синтез второй цепи
  • 2 Применения
  • 3 Вирусы и ретротранспозоны
  • 4 См. Также
  • 5 Ссылки
  • 6 Внешние ссылки

Синтез

РНК служит шаблоном для синтеза кДНК. В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в целевую геномную ДНК. В молекулярной биологии РНК очищается из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. кДНК затем синтезируется с помощью in vitro обратной транскрипции.

Очистка РНК

РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках-хозяевах и экстрагируется сначала лизирование клеток с последующей очисткой РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с диоксидом кремния и методы экстракции РНК на основе гранул. Методы экстракции различаются в зависимости от исходного материала. Например, для извлечения РНК из растительной ткани требуются дополнительные реагенты, такие как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. Чтобы удалить ДНК и белки, используются ферменты, такие как ДНКаза и протеиназа К. Важно отметить, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз с помощью хаотропных агентов, таких как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем общая РНК отделяется от других клеточных компонентов и осаждается спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого выделения РНК для конкретных приложений. Для выделения определенных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) можно использовать дополнительные методы на основе гранул на основе размера или уникальных участков РНК.

Обратная транскрипция

Синтез первой цепи

Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные матрицы РНК, получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса лейкемии мышей Молони обычно используется из-за ее пониженной активности РНКазы H, подходящей для транскрипции более длинных РНК. Обратная транскриптаза AMV из вируса миелобластоза птиц также может использоваться для матриц РНК с сильными вторичными структурами (т.е. высокой температурой плавления). кДНК обычно генерируют из мРНК для анализов экспрессии генов, таких как RT-qPCR и RNA-seq. мРНК избирательно подвергается обратной транскрипции с использованием праймеров олиго-d T, которые представляют собой обратный комплемент полиаденилированного хвоста на 3'-конце всей мРНК. Оптимизированная смесь праймеров олиго-dT и случайного гексамера увеличивает шанс получения полноразмерной кДНК при одновременном снижении смещения 5 'или 3'. Рибосомная РНК также может быть истощена для обогащения обоих мРНК и неполиаденилированные транскрипты, такие как некоторые некодирующие РНК.

Синтез второй цепи

Результат синтезов первой цепи, гибриды РНК-ДНК, могут обрабатываться в течение нескольких секунд методы синтеза нитей или непосредственно в последующих анализах. Ранний метод, известный как синтез с шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для примирования синтеза второй цепи. Однако затравка носит случайный характер, и шпильочный гидролиз приводит к потере информации. В процедуре Габлера и Хоффмана используется РНКаза H E. Coli для разрыва мРНК, которую заменяют ДНК-полимеразой I E. Coli и запечатывают с помощью ДНК-лигазы E. Coli. Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H в M-MLV для разрыва мРНК с последующим удалением оставшейся РНК путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразы кДНК второй цепи. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.

Приложения

Комплементарная ДНК часто используется в клонировании генов или в качестве генов зондов или при создании библиотеки кДНК. Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы выразить новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, кДНК будет добавлена ​​к реципиенту (а не ко всему гену), потому что ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Неполные последовательности кДНК часто получают в виде тегов экспрессируемых последовательностей.

При амплификации последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), ставшей обычным явлением, обычно проводят обратную транскрипцию в качестве начального шага, за которым следует с помощью ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем конструирования специфичных для последовательности праймеров ДНК, которые гибридизуются с 5'- и 3'-концами области кДНК, кодирующей белок. После амплификации последовательность может быть разрезана с каждого конца нуклеазами и вставлена ​​в одну из множества небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и, возможно, интеграцию в ДНК хозяина. Обычно они также содержат сильный промотор для управления транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.

13 июня 2013 года Верховный суд США постановил в деле Association for Molecular Patology v. Myriad Genetics, что, хотя природные гены человека не могут быть запатентовано, кДНК имеет право на патент, поскольку не встречается в природе.

кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR. Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, синтезированная кДНК второй цепи должна быть лигирована с адаптерами, которые позволяют фрагментам кДНК амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с секвенирующими проточными клетками. В методах анализа генов обычно используются микроматрицы и RT-qPCR для количественного определения уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов.

Вирусы и ретротранспозоны

Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). МРНК используется для того, чтобы вирусные белки захватили хозяйскую клетку.

Пример этого первого шага от вирусной ДНК к кДНК можно увидеть в цикле инфицирования ВИЧ. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями РНК вирусного генома проникать в хозяина. Затем создается копия кДНК посредством обратной транскрипции вирусной РНК, процессу, который облегчается шапероном CypA и связанной с вирусным капсидом обратной транскриптазы.

кДНК также генерируется ретротранспозонами в геномах эукариот.. Ретротранспозоны - это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри генома, а иногда и между геномами через промежуточные соединения РНК. Этот механизм характерен для вирусов, за исключением генерации инфекционных частиц.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-05-15 08:12:29
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте