Анализ GLAD-PCR

Gгидролиз lal и L igation A dapter D Независимый ПЦР анализ (GLAD-PCR assay ) - это новый метод определения сайтов R (5mC) GY, образующихся в ходе de novo метилирования ДНК с DNMTЗA и DNMTЗB ДНК-метилтрансферазы. Анализ GLAD-PCR не требует обработки ДНК бисульфитом.

Метод был специально разработан для определения метилирования интересующего сайта RCGY в геномах человека и млекопитающих сверх соответствующих неметилированных сайтов. Это типичная ситуация для препаратов ДНК из клинических образцов крови и тканей.

Тест GLAD-PCR основан на новом типе ферментов - сайт-специфичных метил-направленных ДНК-эндонуклеазах (ДНК-эндонуклеазы MD). Эти ферменты очень похожи на рестрикционные ферменты по биохимическим свойствам и полностью расщепляют ДНК, но действуют противоположным образом: они расщепляют только метилированную ДНК и совсем не расщепляют неметилированную ДНК.

Сайты узнавания доступных эндонуклеаз MD ДНК

ДНК-метилтрансферазы млекопитающих DNMT1, DNMT3a и DNMT3b катализируют реакцию метилирования ДНК.

• DNMT1 поддерживает паттерн метилирования ДНК in vivo, модифицируя новую цепь после репликации.
• DNMT3a и DNMT3b отвечают за метилирование ДНК de novo, включая аномальное гиперметилирование в раковых клетках.

Хорошо известно, что гиперметилирование CpG-островков в регуляторных областях промотора и / или первого экзона в различных генах часто происходит на ранних стадиях спорадического канцерогенеза. Это приводит к подавлению экспрессии генов в опухолевых клетках, тогда как в здоровой ткани соответствующие гены остаются активными. Таким образом, обнаружение таких эпигенетических биомаркеров является одним из наиболее многообещающих диагностических и прогностических инструментов.

Исследование субстратной специфичности DNMT3a и DNMT3b показало, что оба фермента преимущественно распознают сайт RCGY и модифицируют внутренний CG-динуклеотид с образованием 5 ' -R (5mC) GY-3 '/ 3'-YG (5mC) R-5' последовательность. Один из новых ферментов GlaI распознает и расщепляет сайт R (5mC) GY. Благодаря этой уникальной субстратной специфичности GlaI представляет собой удобный инструмент для идентификации de novo метилированных сайтов в ДНК человека и млекопитающих.

DNMT3 и GLAI равная специфичность

Анализ GLAD-PCR включает 3 простых шага:

1. GlaI гидролиз исследуемой ДНК. На этой стадии гидролизуются только сайты R (5mC) GY. Неметилированные сайты RCGY остаются неразрезанными.
2. Универсальное лигирование адаптера. В качестве адаптера используется олигонуклеотидный дуплекс 5’-CCTGCTCTTTCATCG-3 ’/ 3’-pGGACGAGAAAGTAGCp-5’, где «p» означает фосфат.
3. Последующая ПЦР в реальном времени с зондом Taqman. Геномный праймер и зонд TaqMan предназначены для интересующей области ДНК, другой гибридный праймер состоит из двух частей: одна часть комплементарна универсальному адаптеру, а другая - ДНК в момент гидролиза GlaI. Анализ GLAD-PCR

Анализ проводится в одной пробирке, занимает около 2–3 часов и определяет даже несколько копий ДНК с интересующим сайтом R (5mC) GY.