Войти
Микрофотография, на которой видны отложения амилоида (розовые) в тонкой кишке. 12-перстная кишка с отложением амилоида в собственной пластинке. Амилоид проявляется в виде однородного вещества розового цвета в собственной пластинке и вокруг кровеносных сосудов. 20-кратное увеличение. Амилоиды представляют собой агрегаты белков, характеризующиеся фибриллярной морфологией 7–13 нм при диаметре, β-лист вторичная структура (известная как перекрестный β) и способность окрашиваться определенными красителями, такими как Конго красный. В организме человека амилоиды связаны с развитием различных заболеваний. Патогенные амилоиды образуются, когда ранее здоровые белки теряют свою нормальную структуру и физиологические функции (неправильное свертывание ) и образуют фиброзные отложения в бляшках вокруг клеток, которые может нарушить нормальное функционирование тканей и органов.
Такие амилоиды были связаны (но не обязательно в качестве причины) более чем 50 заболеваний человека, известных как амилоидоз, и могут играть роль в некоторых нейродегенеративных расстройства. Некоторые из этих заболеваний носят в основном спорадический характер, и лишь некоторые случаи являются семейными. Остальные только семейные. Некоторые из них ятрогены, поскольку являются результатом лечения. Один амилоидный белок является инфекционным и называется прионом, в котором инфекционная форма может действовать как матрица для преобразования других неинфекционных белков в инфекционную форму. Амилоиды также могут иметь нормальные биологические функции; например, в образовании фимбрий в некоторых родах бактерий , передаче эпигенетических признаков у грибов, а также отложении пигментов и высвобождении гормонов у людей.
Известно, что амилоиды возникают из многих различных белков. Эти полипептидные цепи обычно образуют структуры β-лист, которые объединяются в длинные волокна; однако идентичные полипептиды могут складываться в несколько различных амилоидных конформаций. Разнообразие конформаций могло привести к различным формам прионных заболеваний.
Амилоид прионного пентамера HET-s (218-289), Podospora anserina (PDB : 2 нм ). Приходит название амилоид из раннего ошибочного определения Рудольфом Вирхова вещества как крахмал (амилум на латинском, от греческого μυλον amylon) на основе неочищенные методы окрашивания йодом. Какое-то время научное сообщество спорило о том, являются ли отложения амилоида жировыми отложениями или углеводными отложениями, пока, наконец, не было обнаружено (в 1859 г.), что они, по сути, являются отложениями альбумоид белковый материал.
На сегодняшний день обнаружено, что 37 человеческих белков образуют амилоид при патологии и быть связаны с четко определенными заболеваниями. Международное общество амилоидоза классифицирует амилоидные фибриллы и связанные с ними заболевания на основе ассоциированных белков (например, ATTR - это группа заболеваний и ассоциированных фибрилл, образованных TTR ). Таблица приведена ниже.
Многие примеры не -патологический амилоид с четко определенной физиологической ролью был идентифицирован у различных организмов, включая человека. Их можно назвать функциональными, физиологическими или нативными амилоидами.
Амилоиды состоят из длинных неразветвленных волокон, которые характеризуются протяженной вторичной структурой бета-листа, в которой отдельные β-нити (цветные стрелки на рисунке справа) являются расположены в ориентации, перпендикулярной оси волокна. Такая структура известна как перекрестная β-структура. Каждое отдельное волокно может иметь ширину 5–15 нанометров и длину несколько микрометров. Основным признаком классификации белковых агрегатов как амилоида, признанным различными специалистами, является наличие фибриллярной морфологии ожидаемого диаметра, обнаруженной с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM) или атомно-силовой микроскопии ( AFM), наличие перекрестной β-вторичной структуры, определяемой с помощью кругового дихроизма, FTIR, твердотельного ядерного магнитного резонанса (ssNMR), Рентгеновская кристаллография или дифракция рентгеновских лучей на волокнах (часто считается «золотым стандартом», чтобы определить, содержит ли структура поперечные β-волокна), а также способность окрашивать специфическими красители, такие как конго красный, тиофлавин T или тиофлавин S.
Термин «кросс-β» был основан на наблюдении двух наборов дифракционных линий, одной продольный и один поперечный, образующие характерный «крестовый» рисунок. Имеются два характерных сигнала дифракции рассеяния, возникающие при 4,7 и 10 Ангстрем (0,47 нм и 1,0 нм), соответствующие расстояниям между нитями и расстояниям наложения в бета-листах. «Стеки» бета-листов короткие и пересекают амилоидную фибриллу; длина амилоидной фибриллы состоит из выровненных β-тяжей. Схема перекрестного β считается диагностическим признаком амилоидной структуры.
Амилоидные фибриллы обычно состоят из 2–8 протофиламентов (на рисунке показаны четыре), каждый диаметром 2–7 нм, которые взаимодействуют латерально. в виде плоских лент с высотой 2–7 нм (высота одиночного протофиламента) и шириной 30 нм; чаще протофиламенты скручиваются друг с другом, образуя фибриллы шириной 5-15 нм. Каждая протофиламент имеет типичную поперечную β-структуру и может быть образована 1–4 β-листами (два показаны на рисунке), наложенными друг на друга. Каждая отдельная молекула белка может вносить вклад от одной до нескольких β-цепей в каждом протофиламенте, и эти цепи могут быть расположены в антипараллельных β-листах, но чаще в параллельных β-листах. Лишь часть полипептидной цепи находится в конформации β-цепи в фибриллах, остальная часть образует структурированные или неструктурированные петли или хвосты.
В течение долгого времени наши знания о структуре амилоидных фибрилл на атомном уровне были ограничены тем фактом, что они не подходят для наиболее традиционных методов изучения структур белков. В последние годы наблюдается прогресс в экспериментальных методах, включая твердотельную ЯМР спектроскопию и криоэлектронную микроскопию. В совокупности эти методы позволили получить трехмерные атомные структуры амилоидных фибрилл, образованных β-амилоидными пептидами, α-синуклеином, тау и белком FUS, связанными с различными нейродегенеративными заболеваниями.
Исследования дифракции рентгеновских лучей микрокристаллов выявили атомистические детали области ядра амилоида, хотя только для упрощенных пептидов, имеющих длину значительно короче, чем у пептидов или белков, вовлеченных в заболевание. Кристаллографические структуры показывают, что короткие участки от склонных к амилоиду областей амилоидогенных белков проходят перпендикулярно оси филамента, что согласуется с особенностью «перекрестного β» амилоидной структуры. Они также обнаруживают ряд характеристик амилоидных структур - соседние β-листы плотно упакованы вместе через границу раздела, лишенную воды (поэтому называемую сухой границей раздела), с противоположными β-нитями, слегка смещенными друг от друга, так что их стороны цепи переплетены. Созданный компактный обезвоженный интерфейс был назван интерфейсом стерической молнии. Существует восемь теоретических классов интерфейсов стерической молнии, продиктованных направленностью β-листов (параллельными и антипараллельными) и симметрией между соседними β-листами. Ограничение рентгеновской кристаллографии для определения структуры амилоида представлено необходимостью формирования микрокристаллов, что может быть достигнуто только с пептидами короче пептидов, связанных с заболеванием.
Хотя настоящие амилоидные структуры всегда основаны на межмолекулярных β-листах, наблюдались или предлагались различные типы третичных складок «более высокого порядка». Β-листы могут образовывать β-сэндвич или β-соленоид, который может быть либо β-спиралью, либо β-валком. Также были предложены нативные амилоидные фибриллы, в которых белки, содержащие нативный β-слой, сохраняют свою нативную структуру в фибриллах.
Одним из факторов, усложняющих исследования амилоидогенных полипептидов, является то, что идентичные полипептиды могут складываться в несколько различных амилоидные конформации. Это явление обычно описывается как полиморфизм амилоида. Это имеет заметные биологические последствия, учитывая, что считается, что он объясняет феномен штамма приона.
Три фазы образования амилоидных фибрилл: лаг-фаза, экспоненциальная фаза и фаза плато.Амилоид образуется через полимеризация сотен и тысяч мономерных пептидов или белков в длинные волокна. Образование амилоида включает фазу запаздывания (также называемую фазой зародышеобразования ), фазу экспоненциальной (также называемую фазой роста) и фазу плато (также называемая фазой насыщения), как показано на рисунке. Действительно, когда количество фибрилл отображается в зависимости от времени, наблюдается сигмоидальный временной ход, отражающий три отдельные фазы.
В простейшей модели «нуклеированной полимеризации» (отмеченной красными стрелками на рисунке ниже) отдельные развернутые или частично развернутые полипептидные цепи (мономеры) превращаются в ядро (мономер или олигомер ) посредством термодинамически неблагоприятного процесса, который происходит на ранней стадии лаг-фазы. Фибриллы впоследствии растут из этих ядер за счет добавления мономеров в экспоненциальной фазе.
Другая модель, называемая «нуклеарная конформационная конверсия» и отмеченная синими стрелками на рисунок ниже был введен позже, чтобы соответствовать некоторым экспериментальным наблюдениям: часто было обнаружено, что мономеры быстро превращаются в неправильно свернутые и сильно дезорганизованные олигомеры, отличные от ядер. Лишь позже эти агрегаты реорганизуются структурно в ядра, к которым другие неорганизованные олигомеры будут добавляться и реорганизовываться с помощью механизма шаблонов или индуцированной подгонки (эта модель «ядерной конформационной конверсии»), в конечном итоге формируя фибриллы.
Обычно свернутые белки должны частично развернуться, прежде чем агрегация может происходить посредством одного из этих механизмов. Однако в некоторых случаях свернутые белки могут агрегироваться, не пересекая основной энергетический барьер для развертывания, за счет заселения нативных конформаций в результате тепловых флуктуаций, высвобождения лиганда или локального развертывания. при определенных обстоятельствах. В этих нативно-подобных конформациях сегменты, которые обычно скрыты или структурированы в полностью сложенных и обладающих высокой склонностью к агрегированию, становятся открытыми для растворителя или гибкими, что позволяет формировать нативно-подобные агрегаты, которые впоследствии превращаются в ядра и фибриллы. Этот процесс называется «нативной агрегацией» (зеленые стрелки на рисунке) и похож на модель «ядерной конформационной конверсии».
Более свежая, современная и полная модель образования амилоидных фибрилл включает вмешательство вторичных событий, таких как «фрагментация», при которой фибрилла распадается на две или более более короткие фибриллы, и «вторичное зародышеобразование» в какие поверхности фибрилл (а не концы фибрилл) катализируют образование новых ядер. Оба вторичных события увеличивают количество концов фибрилл, способных рекрутировать новые мономеры или олигомеры, тем самым ускоряя образование фибрилл. Эти события добавляют к хорошо известным стадиям первичной нуклеации (образование ядра из мнономеров с помощью одной из моделей, описанных выше), удлинения фибрилл (присоединение мономеров или олигомеров к растущим концам фибрилл) и диссоциации (противоположный процесс).
Такая новая модель описана на рисунке справа и включает использование «основного уравнения», которое включает все этапы образования амилоидных фибрилл, то есть первичное зародышеобразование, удлинение фибрилл, вторичное зародышеобразование и фрагментацию фибрилл. константы скорости различных этапов могут быть определены из общей подгонки ряда временных курсов агрегации (например, флуоресценции ThT в зависимости от времени), записанных при различных концентрациях белка. 122>
Следуя этому аналитическому подходу, стало очевидно, что лаг-фаза не обязательно соответствует только образованию зародышей, а скорее является результатом комбинации различных этапов. Точно так же экспоненциальная фаза - это не только удлинение фибрилл, но и является результатом комбинации различных этапов, включая первичное зародышеобразование, удлинение фибрилл, но также и вторичные события. Значительное количество фибрилл, возникающих в результате первичного зародышеобразования и удлинения фибрилл, может образовываться во время фазы задержки, и вторичные стадии, а не только удлинение фибрилл, могут быть доминирующими процессами, способствующими росту фибрилл во время экспоненциальной фазы. Согласно этой новой модели, любые агенты, нарушающие образование амилоидных фибрилл, такие как предполагаемые лекарства, метаболиты, мутации, шапероны и т. Д., можно отнести к определенной стадии образования фибрилл.
В целом, амилоид полимеризация (агрегация или нековалентная полимеризация) чувствительны к последовательности, то есть мутации в последовательности могут вызывать или предотвратить самостоятельную сборку. Например, люди продуцируют амилин, амилоидогенный пептид, связанный с диабетом типа II, но у крыс и мышей пролины замещаются в критических местах, и амилоидогенеза не происходит. Исследования по сравнению синтетического и рекомбинантного β-амилоидного пептида в анализах, измеряющих скорость фибрилляции, гомогенность фибрилл и клеточную токсичность, показали, что рекомбинантный β-амилоидный пептид имеет более высокую скорость фибрилляции и большую токсичность, чем синтетический β-амилоидный пептид.
Существует несколько классов амилоид-образующих полипептидных последовательностей. Богатые глутамином полипептиды важны в амилоидогенезе прионов дрожжей и млекопитающих, а также в нарушениях тринуклеотидных повторов, включая болезнь Хантингтона. Когда полипептиды, богатые глутамином, находятся в конформации β-слоя, глутамины могут укреплять структуру, образуя межцепочечные водородные связи между его амидными карбонилами и атомами азота как основной цепи, так и боковых цепей. Возраст начала болезни Гентингтона показывает обратную корреляцию с длиной полиглутаминовой последовательности, с аналогичными данными для C. elegans модельная система с сконструированными пептидами полиглутамина.
Другие полипептиды и белки, такие как амилин и β-амилоидный пептид, не имеют простой консенсусной последовательности и являются Считается, что агрегация осуществляется через сегменты последовательности, обогащенные гидрофобными остатками, или остатки с высокой склонностью к образованию β-листовой структуры. Среди гидрофобных остатков ароматические аминокислоты обладают самой высокой склонностью к амилоидогену.
Перекрестная полимеризация (фибриллы одной полипептидной последовательности вызывают образование других фибрилл другой последовательности) наблюдается in vitro и, возможно, in vivo. Этот феномен важен, поскольку он объясняет межвидовое прионное распространение и разные скорости распространения прионов, а также статистическую связь между болезнью Альцгеймера и диабетом 2 типа. В целом, чем больше сходна пептидная последовательность, тем более эффективна кросс-полимеризация, хотя полностью несходные последовательности могут кросс-полимеризоваться, и очень похожие последовательности могут даже быть «блокаторами», предотвращающими полимеризацию.
Причины, по которым амилоид вызывает заболевания, неясны. В некоторых случаях отложения физически нарушают архитектуру ткани, предполагая нарушение функции каким-то объемным процессом. Возникающий консенсус предполагает, что префибриллярные промежуточные соединения, а не зрелые амилоидные волокна, вызывают гибель клеток, особенно при нейродегенеративных заболеваниях. Однако фибриллы далеко не безобидны, поскольку они поддерживают сеть гомеостаза белка, высвобождают олигомеры, вызывают образование токсичных олигомеров посредством вторичного зародышеобразования, бесконечно растут, распространяясь от района к району, а в некоторых случаях сами могут быть токсичными.
Было обнаружено, что нарушение регуляции кальция происходит на ранней стадии в клетках, подвергшихся действию белковых олигомеров. Эти небольшие агрегаты могут образовывать ионные каналы через двухслойные липидные мембраны и активировать рецепторы NMDA и AMPA. Было высказано предположение, что образование каналов объясняет дисрегуляцию кальция и митохондриальную дисфункцию за счет беспорядочной утечки ионов через клеточные мембраны. Исследования показали, что отложение амилоида связано с митохондриальной дисфункцией и, как следствие, образованием активных форм кислорода (ROS), которые могут инициировать сигнальный путь, ведущий к апоптозу. Имеются сообщения, указывающие на то, что амилоидные полимеры (например, полимеры хантингтина, связанные с болезнью Хантингтона) могут вызывать полимеризацию основных амилоидогенных белков, которые должны быть вредными для клеток. Кроме того, могут быть изолированы партнеры взаимодействия этих основных белков.
Все эти механизмы токсичности, вероятно, играют роль. Фактически, агрегация белка порождает множество агрегатов, все из которых, вероятно, в той или иной степени токсичны. После воздействия таких видов на клетки и животных, независимо от их идентичности, было выявлено большое количество разнообразных биохимических, физиологических и цитологических нарушений. Сообщалось также, что олигомеры взаимодействуют с множеством молекулярных мишеней. Следовательно, маловероятно, что существует уникальный механизм токсичности или уникальный каскад клеточных событий. Неправильно свернутый характер белковых агрегатов вызывает множество аберрантных взаимодействий с множеством клеточных компонентов, включая мембраны, белковые рецепторы, растворимые белки, РНК, малые метаболиты и т. Д.
In В клинических условиях амилоидные заболевания обычно идентифицируются по изменению спектроскопических свойств плоских ароматических красителей, таких как тиофлавин T, конго красный или НИАД-4. В общем, это связано с изменением окружающей среды, поскольку эти красители интеркалируют между бета-цепями, чтобы ограничить их структуру.
Положительный результат по Конго Ред остается золотым стандартом для диагностики амилоидоза.. В общем, связывание конго красного с амилоидными бляшками дает типичное яблочно-зеленое двойное лучепреломление при просмотре в кросс-поляризованном свете. В последнее время значительное увеличение квантового выхода флуоресценции NIAD-4 было использовано для получения изображения флуоресценции амилоидных фибрилл и олигомеров со сверхвысоким разрешением. Чтобы избежать неспецифического окрашивания, другие пятна гистологии, такие как краситель гематоксилином и эозином, используются для подавления активности красителей в других местах, таких как ядро, где краситель может связываться. Современные технологии антител и иммуногистохимия упростили специфическое окрашивание, но часто это может вызвать проблемы, поскольку эпитопы могут быть скрыты в амилоидной складке; в целом структура амилоидного белка отличается от конформации, которую распознает антитело.
 | Викискладе есть материалы, связанные с амилоидом. |
