Войти
Ангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов из существующих кровеносных сосудов. Это очень сложный процесс, включающий обширное взаимодействие между клетками, растворимыми факторами и внеклеточным матриксом (ECM). Ангиогенез имеет решающее значение во время нормального физиологического развития, но он также возникает у взрослых во время воспаления, заживления ран, ишемии и при патологических состояниях, таких как ревматоидный артрит, гемангиома и опухоль рост. Протеолиз был указан как одно из первых и наиболее устойчивых видов деятельности, участвующих в образовании новых кровеносных сосудов. Многочисленные протеазы, включая матриксные металлопротеазы (MMP), домен дезинтегрина и металлопротеазы (ADAM ), домен дезинтегрина и металлопротеиназы с тробоспондиновыми мотивами (ADAMTS ), а цистеиновые и сериновые протеазы участвуют в ангиогенезе. В этой статье основное внимание уделяется важной и разнообразной роли, которую эти протеазы играют в регуляции ангиогенеза.
ММП представляют собой большое мультигенное семейство цинк-зависимых эндопептидаз. Коллективное семейство MMP способно разрушать все известные макромолекулы ECM. Активность ММП регулируется на уровне транскрипции, посттрансляционно посредством протеолитического расщепления и эндогенных ингибиторов, известных как тканевые ингибиторы металлопротеаз (ТИМП). Роль матриксных металлопротеаз и TIMP в нескольких патологических состояниях, включая ангиогенез, рост опухоли и метастазирование, была изучена и очень хорошо описана.
Матричные металлопротеиназы содержат пять консервативных доменов / мотивов последовательности:
Существует также подсемейство матричных металлопротеаз, ММР мембранного типа (MT- MMPs), которые содержат дополнительный трансмембранный домен и короткий цитоплазматический домен. После активации MMP путем удаления пропептидного домена их активность регулируется TIMP. ТИМП специфически и обратимо ингибируют активность ММП. К настоящему времени идентифицировано четыре члена семейства TIMP1–4. Все ТИМП содержат двенадцать консервативных остатков цистеина, которые образуют шесть дисульфидных связей. С-концевые домены ТИМП очень вариабельны и придают их специфичность по отношению к предпочтительным мишеням ММП.
ADAM17 ADAM включают семейство интегральных мембран, а также секретируемые гликопротеины, которые связаны между собой. к металлопротеазам и ММП змеиного яда. Как и MMP, ADAM состоят из нескольких консервативных доменов. Они содержат пропептидные, металлопротеазные, дезинтегриноподобные, богатые цистеином и эпидермальные факторы роста подобные домены, хотя у неживотных организмов наблюдались вариации в составе доменов. Мембранные заякоренные ADAM содержат трансмембранный и цитоплазматический домен. Домены, входящие в семейство ADAM, были охарактеризованы с раскрытием их функциональных и структурных ролей. ADAM содержат консенсусную последовательность, которая имеет три остатка гистидина, которые связываются с каталитически важным ионом цинка. Пропептид удаляется посредством расщепления протеазой типа фурин, давая активный фермент. Пропептид большинства MMP расщепляется протеазами, такими как трипсин, плазмин, химотрипсин и другими MMP. ADAM участвуют в широком спектре процессов ремоделирования клеточной поверхности, включая отщепление эктодомена, регуляцию доступности факторов роста и опосредование взаимодействий между клеткой и матрицей. ADAM17 и ADAM15 недавно были идентифицированы в эндотелиальных клетках (EC).
ADAMTS - это подсемейство связанных с ADAM металлопротеаз, которые содержат не менее один повторяющийся мотив последовательности тромбоспондина типа I (TSR). Это секретируемые белки; а TSR облегчает их локализацию в ECM, помещая его в непосредственной близости от их подложек. Функционально ADAMTS можно разделить на три группы: проколлагенаминопептидаза, аггреканаза и ADAMTS13, который расщепляет фактор фон Виллебранда. В отличие от MMP, TIMP более избирательны по своей способности ингибировать ADAM и ADAMTS. TIMP3 способен ингибировать ADAM17 и 12, а также ADAMTS4 и 5. ADAM8 и ADAM9 не восприимчивы к ингибирование TIMP.
Было идентифицировано много дополнительных классов ферментов, которые способствуют ангиогенезу. Они включают протеазы серинового, аспарагинового и цистеинового типа. Хорошо охарактеризованным примером семейства сериновых протеаз является система активатор плазминогена - плазмин, которая, как было показано, участвует в ремоделировании сосудов. Тканевый активатор плазминогена (tPA) и активатор плазминогена урокиназы (урокиназа, uPA) представляют собой сериновые протеазы, которые расщепляют и активируют плазминоген. Активированная форма плазминогена, плазмин, представляет собой протеазу широкого диапазона, способную действовать на различные компоненты ECM, включая фибрин, коллагены, ламинин <156.>, фибронектин и протеогликаны. Кроме того, плазмин также способен активировать различные другие ММП.
У людей группа катепсина цистеиновых протеаз или цистеиновых катепсинов включает 11 членов семейства, катепсины B, C, F, H, L1, L2, K, O, S, W и X / Z. Цистеиновые катепсины синтезируются как неактивные зимогены и активируются протеолитическим удалением их пропептида. Эти ферменты в основном локализованы в лизосомах и участвуют в конечной деградации и процессинге белка. Катепсины также могут секретироваться клетками, связываться с поверхностью клетки и разрушать ECM. Исследование всех 11 членов семейства катепсинов подчеркивает их важность в онкогенезе и опухолевом ангиогенезе. Исследование активности катепсина с использованием химических зондов и in vivo методов визуализации продемонстрировало увеличение активности катепсина в ангиогенных кровеносных сосудах и инвазивных фронтах карциномы на модели панкреатического островка у трансгенных мышей RIP-Tag2 опухолевый генез.
Аминопептидазы действуют как экзопептидазы, которые удаляют аминокислоты с амино-конца белков. Аминопептидаза N (CD13 / APN) высоко экспрессируется на эндотелии растущих сосудов. Ингибиторы CD13 / APN резко замедляют рост опухоли.
Схема выделения эктодомена металлопротеиназы ADAM. В последние годы стало ясно, что выделение эктодомена является начальным шагом для активации специфических рецепторов, таких как как Notch, ErbB-4 и рецептор ангиопоэтина Tie-1. Notch-1 передача сигналов важна для дифференцировки эндотелия и ангиогенеза опухоли, тогда как рецептор ангиопоэтина Tie-1 способствует образованию эмбриональных кровеносных сосудов. После связывания своих лигандов Notch-1 и Tie-1 подвергаются протеолитическому расщеплению эктодоменов ADAM17 и ADAM10. Это расщепление освобождает цитоплазматический фрагмент для передачи клеточных сигналов. В случае Notch-1 он передается в ядро.
Многие цитокины и факторы роста синтезируются в виде мембраносвязанных проформ, которые подвергаются протеолитическому отщеплению для активации. Эфрины EPH рецептор A2 и A3 выделяются ADAM10, создавая расщепленные растворимые Eph рецепторы, которые ингибируют ангиогенез опухоли у мышей. Дополнительными примерами являются протеолитическое выделение растворимого E-селектина, выделение рецептора урокиназы (uPAR) с помощью MMP-12 с образованием растворимого uPAR, который имеет хемотаксический свойства для лейкоцитов и клеток-предшественников, а также выделение рецепторов интерлейкина-6 с помощью ADAM10 и ADAM17, что способствует передаче сигналов интерлейкина-6 в эндотелиальных клетках. Семафорин 4D отщепляется от его мембраносвязанной формы MT1-MMP (MMP-14) в опухолевых клетках; затем он взаимодействует с плексином B1 на эндотелиальных клетках, способствуя проангиогенному хемотаксису. Выделение заякоренного в мембране цитокина или фактора роста протеиназами ADAM может иметь значение для различных событий передачи сигнала. Альтернативно, для диффузии лиганда к удаленным рецепторам может потребоваться отщепление. Шеддинг может потребоваться для подавления сигналов путем удаления сигнальных лигандов или расщепления и высвобождения рецепторов. Высвобождение рецептора может также генерировать растворимые рецепторы, которые действуют как ловушки, изолируя лиганды. Эти находки показывают, что шеддинг эктодомена является повсеместным процессом, способствующим широкому разнообразию клеточных событий, участвующих в ангиогенезе. Поскольку генерируются мощные биологические модификаторы, это, вероятно, контролируется строго регулируемым механизмом. Наряду с ADAM и MT-MMP, мембраносвязанные сериновые протеазы также могут играть роль в отщеплении эктодоменов.
Иллюстрация, изображающая внеклеточный матрикс по отношению к эпителию, эндотелию и соединительной ткани. Образование капилляры из ранее существовавших кровеносных сосудов требуют ремоделирования как пикапиллярной мембраны родительской венулы, так и локального и дистального ECM. В начале ангиогенеза эндотелиальные клетки (ЭК) должны ремоделировать три разных барьера, чтобы мигрировать и проникнуть в ткань-мишень. Сначала идет базальная мембрана между эндотелием и сосудистыми гладкомышечными клетками или перицитами, за которым следует гель фибрина, образованный из фибриногена, который просачивается из сосудистой сети, и наконец, внеклеточный матрикс в ткани-мишени. Базальная мембрана сосудов состоит из коллагена IV типа, коллагена XVIII типа, ламининов, энтактина, гепарансульфата протеогликаны, перлекан и остеонектин. Все эти компоненты базальной мембраны являются субстратами для MMP-2, 3, 7 и 9, среди прочих. Ингибиторы активности ММП подчеркивают важность этих белков в контроле ангиогенеза. Недавно было обнаружено, что малая интерферирующая РНК (миРНК) опосредует деградацию РНК-мишени рецептора урокиназы, а ММР-9 ингибирует образование капиллярно-подобных структур в моделях ангиогенеза как in vitro, так и in vivo. Пройдя свой путь через базальную мембрану, ЭК должны проникнуть через плотный фибриновый гель, который полимеризуется из фибриногена, полученного из сосудистого русла. Плазмин, эффективный фибринолизин, продуцируемый tPA или uPA, считается важным в этом процессе, но мыши с дефицитом плазминогена не обнаруживают серьезных дефектов неоваскуляризации в богатых фибрином тканях. Эти находки подчеркивают разнообразие протеолитических ферментов, которые ЭК используются для ремоделирования ВКМ. Например, ММР-3, 7, 8, 12 и 13 могут расщеплять фибриноген.
Активность ММР является одним из самых ранних и устойчивых процессов, происходящих во время ангиогенеза. Изучая переход бессосудистой опухоли в сосудистую, Fang et al. смогли определить ключевую роль MMP-2 в ангиогенезе. Экспрессия и активность MMP-2 были увеличены в ангиогенных опухолях по сравнению с бессосудистыми опухолями, и добавление антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на MMP-2, ингибирует начало ангиогенеза, поддерживая бессосудистый фенотип. Эти данные наряду с другими сообщениями предполагают, что активность ММП необходима для инициации самых ранних стадий ангиогенеза и развития опухоли. Создание мышей с дефицитом ММП дало важное понимание роли ММП в регуляции ангиогенеза. Например, мыши с нокаутом MMP-2 развиваются нормально, но демонстрируют значительное ингибирование ангиогенеза роговицы.
Многочисленные протеолитические фрагменты или домены белков ECM сообщалось, что они оказывают положительное или отрицательное действие на ангиогенез. Нативные белки, которые содержат такие домены с регуляторной активностью, обычно неактивны, скорее всего, потому, что они представляют собой скрытые сегменты, скрытые в структуре природного белка. Ангиостатин представляет собой фрагмент плазминогена 38 кДа с активностью ингибитора ангиогенеза. Фрагменты ангиостатина содержат крингл-домены, которые проявляют свою ингибирующую активность на нескольких различных уровнях; они подавляют миграцию эндотелиальных клеток и пролиферацию, усиливают апоптоз и модулируют активность киназы фокальной адгезии (FAK). Эндостатин представляет собой 20 кДа фрагмент коллагена XVIII. Основная роль эндостатина заключается в его способности сильно ингибировать миграцию эндотелиальных клеток и индуцировать апоптоз. Эти эффекты опосредуются взаимодействием и вмешательством в различные ангиогенные родственные белки, такие как интегрины и серин / треонин-специфические протеинкиназы. Многочисленные исследования продемонстрировали, что тропоэластин, растворимый предшественник эластина или фрагменты протеолитического эластина обладают разнообразными биологическими свойствами. Nackman et al. продемонстрировали, что образующиеся эластазой фрагменты эластина опосредуют несколько характерных признаков аневризматического заболевания, которые коррелируют с ангиогенезом. Остеонектин представляет собой металл-связывающий гликопротеин, продуцируемый многими типами клеток, включая ЭК. Наконец, это недавно описанный ингибитор ангиогенеза, происходящий от карбокси-конца перлекана. Наномолярные концентрации эндорепеллина подавляют миграцию ЭК и ангиогенез в различных моделях in vitro и in vivo, блокируя адгезию ЭК к различным субстратам, таким как фибронектин и коллаген I типа.
Эндогенные ингибиторы или активаторы, образующиеся в результате протеолитической деградации более крупных белков, в основном из ECM, как было доказано, вносят вклад в регуляцию роста опухоли и ангиогенеза. В этой статье упоминается только небольшая часть известных протеолитических фрагментов, которые изменяют поведение и функцию ЭК во время ангиогенеза. Это изобилие привлекло повышенное внимание из-за их потенциала для антиангиогенной и противораковой терапии.
Протеазы не только модулируют взаимодействия клетка-матрица, но также могут контролировать начало и развитие ангиогенеза путем активации ангиогенных факторов роста и цитокинов. Фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста, способствующий ангиогенезу, активируется фактором активации HGF, сериновой протеазой, связанной с плазминогеном. Некоторые факторы роста, такие как основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), улавливаются в ECM различными протеогликанами. Протеолитическая деградация этих протеогликанов высвобождает факторы роста, позволяя им достичь своих рецепторов и влиять на поведение клеток. Факторы роста, которые косвенно влияют на ангиогенез, также являются мишенями протеолитической активации. Например, активаторы плазминогена управляют активацией латентного трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) из костного ECM и, таким образом, модулируют ангиогенез в кости.
Протеазы не только обладают способностью изменять доступность факторов роста, но также может изменять их свойства. Эта способность была показана для VEGF165, который расщепляется MMP-3 или MMP-9 до более мелкой молекулы со свойствами, аналогичными VEGF 121. Эти две изоформы VEGF обладают очень разными свойствами. VEGF 165 индуцирует регулярный паттерн сосудов во время неоваскуляризации опухоли. Напротив, VEGF 121 и усеченный VEGF 165 вызывают нерегулярные модели неоваскуляризации, скорее всего, из-за их неспособности связывать гепарансульфаты, поэтому они не предоставляют никакой пространственной информации, которая является похоронен в ECM. Другой важный фактор в ангиогенезе, фактор-1 стромальных клеток (SDF-1), также модифицируется аминодипептидазой дипептидилпептидазой-4 (DPP4). Расщепление SDF-1 снижает его сродство к гепарансульфату, и взаимодействия с его рецептором CXCR4 уменьшаются. Семейство протеаз ADAM привлекает повышенное внимание из-за их способности изменять баланс между про- и антиангиогенными факторами. ADAM17 способен высвобождать активный фактор некроза опухоли-альфа (TNFα) и гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF) из своих мембраносвязанных предшественников, которые могут косвенно влиять на ангиогенез..
Протеазы не только способствуют ангиогенезу, но также обладают способностью тормозить этот процесс. Одним из примеров этого является обработка ингибиторов ангиогенеза ММП. Как описано ранее, было показано, что ММР расщепляют плазминоген и коллаген XVIII на эндогенные ингибиторы ангиогенеза ангиостатин и эндостатин. Сама MMP-2 обладает антиангиогенными свойствами, которые не зависят от ее каталитического домена. Взаимодействия между интегрином α vβ3 и ММР-2 на поверхности клеток ЕС могут быть необходимы для активности ММП-2 во время ангиогенеза. Гемопексиноподобный домен на карбокси-конце MMP-2 способен блокировать это взаимодействие активного MMP-2 и интегрина α vβ3на поверхности EC, что приводит к ингибированию активности MMP-2.
Во время ангиогенез ADAM15 предпочтительно экспрессируется на EC. ADAM15 способен взаимодействовать с интегринами α vβ3и α5β1 через свой дезинтегриновый домен через мотив RGD (аргинин - глицин - аспарагиновая кислота ). Большинство дезинтегринов содержат этот консервативный мотив RGD, но ADAM15 является единственным членом семейства ADAM, содержащим этот мотив. Рекомбинантный дезинтегриновый домен человеческого ADAM15 ингибирует ряд функций ЭК in vitro, включая пролиферацию, адгезию, миграцию и образование капилляров. Сверхэкспрессия домена дезинтегрина ADAM15 приводила к ингибированию ангиогенеза, роста опухоли и метастазирования. С другой стороны, не было показано, играет ли полноразмерный ADAM15 ингибирующую роль in vivo. ADAMTS1 и ADAMTS8 ингибируют ангиогенез in vitro в двух функциональных анализах ангиогенеза. Оба фермента ингибируют индуцированную bFGF васкуляризацию в анализе кармана роговицы и ингибируют индуцированный VEGF ангиогенез в анализе хориоаллантоисной мембраны. Все вместе эти данные указывают на то, что протеазы могут функционировать как положительные, так и отрицательные регуляторы ангиогенеза.
Ангиогенез требует миграции и инвазивного роста клеток. Этому способствует сбалансированное взаимодействие между отрывом и образованием клеточных адгезий, которые позволяют клетке продвигаться вперед через ECM. Клетка использует ограниченную протеолитическую активность в местах отдельных очаговых спаек за счет образования мультибелковых комплексов. Мультипротеиновые комплексы локализуются в липидных рафтах на поверхности клетки, куда часто включаются мембраносвязанные протеазы. Например, лейкоцитарный комплекс урокиназы (uPA), рецептор урокиназы (uPAR) и интегрины, которые участвуют в адгезии и инвазии клеток. В этих комплексах uPAR действует как организующий центр, образуя нековалентные комплексы с интегринами, LRP -подобными белками и урокиназой. Подобные комплексы также встречаются на ЭК.
Протеолитическая активность, которая имеет место во время ангиогенеза, требует точной пространственной и временной регуляции. Если бы не этот контроль, чрезмерный протеолиз мог бы привести к повреждению ткани и потере точек крепления для мигрирующих клеток. Это проиллюстрировано на мышах, дефицитных по ингибитору активатора плазминогена-1 (PAI-1). PAI-1 ингибирует активаторы плазминогена и, следовательно, активацию плазмина; поэтому можно было предположить, что дефицит PAI-1 будет увеличивать ангиогенез и рост опухоли. Неожиданно, когда мышей с дефицитом PAI-1 заражали раковыми клетками на коллагеновой матрице, ангиогенез и стабилизация сосудов подавлялись, что препятствовало росту опухоли. Это открытие было связано с защитными свойствами, которые PAI-1 придает против чрезмерной деградации окружающего ЕСМ плазмином. Без этой защиты разрушаются точки опоры, используемые эндотелиальными клетками для миграции и формирования капиллярных структур. Неконтролируемый протеолиз также объясняется нарушением развития сосудов и преждевременной гибелью эмбрионов мышей, лишенных ингибитора индуцирующего реверсию белка, богатого цистеином, с мотивами казала (RECK). Скорее всего, это связано с неконтролируемой активностью ММП, поскольку частичное спасение было достигнуто одновременным отключением RECK и MMP-2.
Лейкоциты и эндотелиальные клетки-предшественники (EPCs) способствуют инициированию и направлению новых кровеносных сосудов. Моноциты продуцируют множество проангиогенных факторов. Существует также популяция CD34 положительных клеток, которые могут экспрессировать связанные с эндотелием белки, такие как VE-кадгерин и рецептор домена вставки киназы (KDR, рецептор VEGF 2), которые помогают влиять на развитие ангиогенеза. Отсутствие или дисфункция этих клеток причастны к нарушению васкуляризации у сердечных и диабетических пациентов. MMP-9 играет ключевую роль в мобилизации EPC из костного мозга. Heissig et al. предложили механизм того, как MMP-9 способствует доступности EPC для ангиогенеза. Во-первых, циркулирующий VEGF индуцирует экспрессию MMP-9 в костном мозге, затем MMP-9 способна расщеплять и высвобождать лиганд c-kit. Затем активированный c-kit способен привлекать гематопоэтические, эндотелиальные и тучные клетки клетки-предшественники, эти клетки затем накапливаются в ангиогенной области и продуцируют большие количества VEGF склоняет чашу весов в пользу ангиогенеза.
MMP-9 не единственная протеаза, которая, как было показано, участвует в усиленном EPC ангиогенезе. Катепсин L активен при нейтральном pH за счет связывания со сплайс-вариантом MHC класса II инвариантной цепи, который сильно экспрессируется в EPC. Эта способность оставаться активными при нейтральном pH может способствовать инвазии EPC, ремоделированию матриксных коллагенов и желатина и неоваскуляризации. Нокаут катепсина L у мышей показал нарушение восстановления кровотока в ишемизированных конечностях, что указывало на нарушение неоваскуляризации. Неоваскуляризация также нарушается у мышей, получавших клетки костного мозга, дефицитные по катепсину L, по сравнению с клетками дикого типа. Мишень, с помощью которой катепсин L стимулирует ангиогенез, еще не идентифицирована.
MT1-MMP (MMP-14) Точно установлено, что гладкие мышечные перициты играют роль важная роль в стабилизации новообразованных кровеносных сосудов. Перициты, присутствующие в строме опухолей больных раком молочной железы, экспрессируют ММР-9. На животных моделях с дефицитом ММП-9 наблюдается нарушение набора перицитов. Невозможность рекрутировать перициты серьезно влияет на стабильность сосудов и степень васкуляризации нейробластом. Аминопептидаза A также может участвовать в рекрутировании перицитов из-за ее повышенной экспрессии активированными перицитами при различных патологических состояниях, связанных с ангиогенезом. Механизм, с помощью которого эта протеаза способствует созреванию сосудов, еще не определен. Ангиогенез требует тонкого баланса между протеолитической активностью и ингибированием протеиназы. Перициты секретируют TIMP-3, который ингибирует MT1-MMP-зависимую активацию MMP-2 на эндотелиальных клетках, тем самым способствуя стабилизации вновь образованных микрососудов. Совместные культуры, состоящие из перицитов и эндотелиальных клеток, индуцируют экспрессию TIMP-3 перицитами, тогда как эндотелиальные клетки продуцируют TIMP-2. Вместе эти ингибиторы стабилизируют сосудистую сеть путем ингибирования множества MMP, ADAM и рецептора 2 VEGF.
Незрелые сосуды остаются зависимыми от постоянного воздействия ангиогенных факторов роста без покрытия перицитами. Когда резервуар факторов роста удаляется, эндотелиальные клетки не выживают и подвергаются апоптозу, индуцированному каспазами, тогда как другие протеазы участвуют в деградации и удалении оставшегося клеточного дебриса.
Протеазы играют многочисленные роли в ангиогенезе как в развитии, так и особенно в патологических состояниях. Поскольку они являются важными регуляторами деградации тканей и миграции клеток, ожидается, что их ингибирование будет полезно для подавления роста опухоли и васкуляризации. Обнадеживающие результаты были получены в исследованиях на животных, но клинические испытания не показали подобных результатов и часто сопровождаются неприемлемыми побочными эффектами. Это повлияло на продолжение исследований, в ходе которых были выявлены новые семейства протеаз, такие как ADAM, ADAMTS и MT-MMP. Возможно, что более важно, возникла новая парадигма, согласно которой протеазы необходимы для модуляции факторов роста и цитокинов, генерации биологически активных фрагментов из матрикса, облегчения рекрутирования клеток, полученных из костного мозга, и стабилизации зрелых кровеносных сосудов. Лучшее понимание различных активностей протеаз и их ингибиторов поможет в более индивидуальном лечении многочисленных заболеваний.
