Войти
Опосредующая интерференция РНК в культивируемых клетках млекопитающих. Малая интерферирующая РНК (siRNA ), иногда известная как короткая интерферирующая РНК или сайленсирующая РНК, представляет собой класс двухцепочечной РНК некодирующей РНК молекулы, обычно длиной 20-27 пар оснований, аналогичные миРНК и действующие в рамках пути РНК-интерференции (РНКи). Он препятствует экспрессии конкретных генов с комплементарными нуклеотидными последовательностями, разрушая мРНК после транскрипции, предотвращая трансляцию.
Природные миРНК имеют четко определенную структуру, которая является короткой (обычно от 20 до 24 частей). bp ) двухцепочечная РНК (дцРНК) с фосфорилированными 5'-концами и гидроксилированными 3'-концами с два выступающих нуклеотида. Фермент Dicer катализирует образование миРНК из длинных дцРНК и малых шпилечных РНК. миРНК также можно вводить в клетки с помощью трансфекции. Поскольку в принципе любой ген может быть сбит синтетической миРНК с комплементарной последовательностью, миРНК являются важным инструментом для проверки функции генов и нацеливания на лекарства в постгеномную эпоху.
миРНК и их роль в пост- транскрипционном подавлении генов (PTGS) были впервые обнаружены у растений Дэвидом Баулкомбом в лаборатории Сейнсбери в Норвиче, Англия, о которых сообщалось в Science в 1999 году. Thomas Tuschl и его коллеги вскоре сообщили в Nature, что синтетические миРНК могут индуцировать РНКи в клетках млекопитающих. Это открытие привело к всплеску интереса к использованию РНКи для биомедицинских исследований и разработки лекарств. Значительные разработки в области терапии миРНК были сделаны с использованием как органических (углеродных), так и неорганических (не углеродных) наночастиц, которые были успешными в доставке лекарств в мозг, предлагая многообещающие методы доставки в людей. Однако остаются значительные препятствия на пути к успешной терапии миРНК, наиболее значительным из которых является нецелевое действие.
Механизм, с помощью которого естественная миРНК вызывает молчание генов посредством репрессии трансляции, происходит следующим образом:
Механизм миРНК siRNA также похожа на miRNA, однако miRNA происходят из более коротких продуктов РНК в виде стержневой петли, обычно подавляя гены путем репрессии трансляции, и обладают более широкой специфичностью действия, тогда как миРНК обычно работают, расщепляя мРНК перед трансляцией, и обладают 100% комплементарностью, таким образом, очень высокой целевой специфичностью.
окрашенный белок Дайсер посредством белкового домена.Нокдаун гена посредством трансфекции экзогенной миРНК часто бывает неудовлетворительным, поскольку эффект является временным, особенно в быстро делящихся клетках. Это можно преодолеть, создав вектор экспрессии для миРНК. Последовательность миРНК модифицируется для введения короткой петли между двумя цепями. Результирующий транскрипт представляет собой короткую шпильочную РНК (кшРНК), которая может быть преобразована в функциональную миРНК с помощью Dicer обычным способом. Типичные кассеты транскрипции используют промотор РНК-полимеразы III (например, U6 или H1) для управления транскрипцией малых ядерных РНК (мяРНК) (U6 участвует в сплайсинге генов ; H1 является РНКаза компонент РНКазы Р человека). Предполагается, что полученный транскрипт siRNA затем обрабатывается Dicer.
Эффективность нокдауна гена также может быть улучшена с помощью сжатия клеток.
Активность siRNAs в RNAi в значительной степени зависит от ее связывающей способности к РНК-индуцированному комплексу сайленсинга (RISC). Связывание дуплексной миРНК с RISC сопровождается раскручиванием и расщеплением смысловой цепи эндонуклеазами. Оставшийся комплекс антисмысловая цепь-RISC может затем связываться с мРНК-мишенью для инициации подавления транскрипции.
Было обнаружено, что дцРНК может также активировать экспрессию генов, механизм, который имеет были названы «активация гена, индуцированная малой РНК» или РНКа. Было показано, что дцРНК, нацеленные на промоторы генов, индуцируют мощную активацию транскрипции ассоциированных генов. РНКа была продемонстрирована в клетках человека с использованием синтетических дцРНК, названных «малыми активирующими РНК» (саРНК ). В настоящее время неизвестно, консервативна ли РНКа у других организмов.
Посттранскрипционное подавление генов, индуцированное миРНК, начинается со сборки РНК-индуцированного сайленсинга комплекс сайленсинга (RISC). Комплекс подавляет экспрессию определенных генов за счет расщепления молекул мРНК, кодирующих гены-мишени. Чтобы начать процесс, одна из двух цепей миРНК, направляющая цепь (антисмысловая цепь), будет загружена в RISC, в то время как другая цепь, пассажирская цепь (смысловая цепь), будет разрушена. Некоторые ферменты Dicer могут нести ответственность за загрузку направляющей цепи в RISC. Затем siRNA сканирует и направляет RISC к идеально комплементарной последовательности молекул мРНК. Считается, что расщепление молекул мРНК катализируется доменом Piwi белков Argonaute RISC. Молекула мРНК затем точно разрезается путем разрыва фосфодиэфирной связи между нуклеотидами-мишенями, которые спарены с остатками миРНК 10 и 11, считая от 5’-конца. Это расщепление приводит к образованию фрагментов мРНК, которые далее разрушаются клеточными экзонуклеазами. Фрагмент 5 'деградируется со своего 3' конца с помощью экзосомы, в то время как 3 'фрагмент разрушается со своего 5' конца с помощью 5 '-3' экзорибонуклеазы 1 (XRN1 ). Диссоциация целевой цепи мРНК от RISC после расщепления позволяет заглушить большее количество мРНК. Этому процессу диссоциации, вероятно, способствуют внешние факторы, вызываемые гидролизом АТФ.
Иногда расщепления целевой молекулы мРНК не происходит. В некоторых случаях эндонуклеолитическое расщепление фосфодиэфирного остова может быть подавлено несовпадением миРНК и целевой мРНК вблизи сайта расщепления. В других случаях белки Argonaute RISC не обладают эндонуклеазной активностью, даже если мРНК-мишень и миРНК идеально спарены. В таких случаях экспрессия гена будет подавлена с помощью механизма, индуцированного miRNA.
Упрощенная версия метода пинг-понга, включающая белки Aubergine (Aub) и Argonaute-3 (Ago3), расщепляющие 3 'и 5' концы пиРНК. Piwi-взаимодействующие РНК несут ответственность за подавление транспозонов и не являются миРНК.
Поскольку РНКи пересекаются с рядом других путей, неудивительно, что иногда неспецифические эффекты запускаются экспериментальным введением siRNA. Когда клетка млекопитающего встречает двухцепочечную РНК, такую как миРНК, она может принять ее за побочный вирусный продукт и вызвать иммунный ответ. Кроме того, поскольку структурно связанные микроРНК модулируют экспрессию генов в значительной степени за счет неполных взаимодействий пар оснований комплементарности с целевой мРНК, введение миРНК может вызвать непреднамеренное отклонение от цели. Химические модификации миРНК могут изменять термодинамические свойства, что также приводит к потере однонуклеотидной специфичности.
Введение слишком большого количества миРНК может привести к неспецифическим событиям из-за активации врожденного иммунитета. ответы. Большинство данных на сегодняшний день предполагают, что это, вероятно, связано с активацией PKR сенсора дцРНК, хотя может также участвовать ген I, индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG-I). Также описана индукция цитокинов через toll-подобный рецептор 7 (TLR7). Химическая модификация siRNA используется для снижения активации врожденного иммунного ответа на функцию генов и терапевтическое применение. Одним из многообещающих методов снижения неспецифических эффектов является преобразование миРНК в микроРНК. МикроРНК встречаются в природе, и, используя этот эндогенный путь, должно быть возможно достичь аналогичного нокдауна гена при сравнительно низких концентрациях образующихся миРНК. Это должно минимизировать неспецифические эффекты.
Нецелевое задание - еще одна проблема для использования миРНК в качестве инструмента нокдауна гена. Здесь гены с неполной комплементарностью непреднамеренно подавляются миРНК (фактически, миРНК действует как миРНК), что приводит к проблемам в интерпретации данных и потенциальной токсичности. Это, однако, может быть частично решено путем разработки соответствующих контрольных экспериментов, и в настоящее время разрабатываются алгоритмы конструирования миРНК для получения миРНК, свободных от мишени. Анализ экспрессии в масштабе всего генома, например, с помощью технологии микрочипов, можно затем использовать для проверки этого и дальнейшего уточнения алгоритмов. В статье 2006 года из лаборатории доктора Хворовой говорится о вовлечении участков длиной 6 или 7 пар оснований, начиная с позиции 2, в соответствие siRNA с областями 3'UTR в генах, не являющихся мишенями.
Простые РНК могут быть плохими иммуногенами, но легко могут быть созданы антитела против комплексов РНК-белок. Многие аутоиммунные заболевания видят эти типы антител. Еще не было сообщений об антителах против миРНК, связанных с белками. Некоторые методы доставки siRNA соединяют полиэтиленгликоль (PEG) с олигонуклеотидом, уменьшая выведение и улучшая период полужизни в кровотоке. Однако недавно Regado Biosciences пришлось прекратить крупное испытание фазы III ПЭГилированного РНК-аптамера против фактора IX из-за тяжелой анафилактической реакции на ПЭГ-часть РНК. Эта реакция в некоторых случаях приводила к смерти и вызывает серьезные опасения по поводу доставки миРНК, когда задействованы ПЭГилированные олигонуклеотиды.
Трансфекция миРНК в клетки обычно снижает экспрессию многих генов, однако также наблюдается усиление активности генов. Повышение экспрессии генов можно частично объяснить предсказанными генами-мишенями эндогенных miRNA. Вычислительный анализ более чем 150 экспериментов по трансфекции миРНК поддерживает модель, в которой экзогенные миРНК могут насыщать эндогенный аппарат РНКи, что приводит к дерепрессии генов, регулируемых эндогенными миРНК. Таким образом, хотя миРНК могут вызывать нежелательные эффекты вне мишени, то есть непреднамеренное подавление мРНК посредством частичного совпадения последовательностей между миРНК и мишенью, насыщение аппарата РНКи является еще одним отличным неспецифическим эффектом, который включает дерепрессию генов, регулируемых miRNA. и приводит к аналогичным проблемам в интерпретации данных и потенциальной токсичности.
siRNA были химически модифицированы для улучшения их терапевтических свойств, таких как повышенная активность, повышенная стабильность сыворотки, меньшее количество нецелевых и сниженных иммунологических активация. Подробная база данных всех таких химических модификаций в научной литературе представлена вручную как siRNAmod. Химическая модификация миРНК также может непреднамеренно привести к потере однонуклеотидной специфичности.
Учитывая способность, по сути, блокировать любой интересующий ген РНКи через миРНК вызвал большой интерес как в фундаментальной, так и в прикладной биологии.
Одной из самых серьезных проблем для терапевтических средств на основе siRNA и RNAi является внутриклеточная доставка. Доставка миРНК через наночастицы оказалась многообещающей. миРНК олигонуклеотидов in vivo уязвимы для деградации плазменными и тканевыми нуклеазами и показали лишь умеренную эффективность в локализованных местах доставки, таких как глаз человека. Доставка чистой ДНК организмам-мишеням является сложной задачей, поскольку ее большой размер и структура не позволяют ей легко диффундировать через мембраны. Олиго siRNA обходят эту проблему из-за их небольшого размера 21-23 олигонуклеотидов. Это позволяет осуществлять доставку через наноразмерные носители для доставки, называемые нановекторами.
Хороший нановектор для доставки миРНК должен защищать миРНК от деградации, обогащать миРНК в органе-мишени и способствовать поглощению миРНК клетками. Три основные группы нановекторов миРНК: липидные, нелипидные органические и неорганические. Липидные нановекторы отлично подходят для доставки миРНК к солидным опухолям, но для других видов рака могут потребоваться другие нелипидные органические нановекторы, такие как наночастицы на основе циклодекстрина.
siRNA, доставляемые с помощью наночастиц на основе липидов, обладают терапевтическим потенциалом при нарушениях центральной нервной системы (ЦНС). Нарушения со стороны центральной нервной системы не редкость, но гематоэнцефалический барьер (BBB) часто блокирует доступ потенциальных терапевтических средств к мозгу. Было показано, что миРНК, которые нацелены на белки оттока на поверхности ГЭБ и заглушают их, создают увеличение проницаемости ГЭБ. siRNA, доставляемая через наночастицы на основе липидов, способна полностью пересекать BBB.
Огромная трудность в доставке siRNA - это проблема нецелевого нацеливания. Поскольку гены считываются в обоих направлениях, существует вероятность того, что даже если предполагаемая антисмысловая цепь миРНК считывается и выбивает целевую мРНК, смысловая цепь миРНК может нацеливаться на другой белок, участвующий в другой функции.
Фаза I Результаты первых двух испытаний терапевтических РНКи (показанных для возрастной дегенерации желтого пятна, также известной как AMD) сообщили в конце 2005 г., что миРНК хорошо переносятся и обладают подходящими фармакокинетическими свойствами.
В В ходе клинического испытания фазы 1 41 пациенту с запущенным раком метастазами в печень вводили РНКи, доставляемую через липидные наночастицы. РНКи нацелены на два гена, кодирующих ключевые белки роста раковых клеток, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF ) и белок кинезинового веретена (KSP ). Результаты показали клиническую пользу: рак либо стабилизировался через шесть месяцев, либо метастазы регрессировали у некоторых пациентов. Фармакодинамический анализ образцов биопсии пациентов выявил присутствие в образцах конструкций РНКи, что доказывает, что молекулы достигли намеченной цели.
Испытания с подтверждением концепции показали, что миРНК, нацеленные на Эболу, могут быть эффективны в качестве постконтактной профилактики у людей, при этом 100% нечеловеческих приматов выживают после смертельной дозы Заирского эболавируса, наиболее смертельного штамма.
Доставка миРНК внутри клетки продолжает оставаться проблемой. Существует три основных метода доставки миРНК, которые различаются по эффективности и токсичности.
В этом методе siRNA сначала должна быть сконструирована против целевого гена. Как только миРНК настроена против гена, она должна быть эффективно доставлена с помощью протокола трансфекции. Доставка обычно осуществляется с помощью катионных липосом, полимерных наночастиц и липидной конъюгации. Этот метод выгоден тем, что он может доставлять миРНК к большинству типов клеток, имеет высокую эффективность и воспроизводимость и предлагается на коммерческой основе. Наиболее распространенными коммерческими реагентами для трансфекции миРНК являются липофектамин и неоновая трансфекция. Однако он не совместим со всеми типами клеток и имеет низкую эффективность in vivo.
Электрические импульсы также используются для внутриклеточной доставки миРНК в клетки. Клеточная мембрана состоит из фосфолипидов, что делает ее чувствительной к электрическому полю. Когда инициируются быстрые, но мощные электрические импульсы, молекулы липидов переориентируются, претерпевая тепловые фазовые переходы из-за нагрева. Это приводит к образованию гидрофильных пор и локализованным возмущениям в липидной двухслойной клеточной мембране, что также вызывает временную потерю полупроницаемости. Это позволяет ускользать от многих внутриклеточных материалов, таких как ионы и метаболиты, а также одновременно поглощать лекарства, молекулярные зонды и нуклеиновые кислоты. Для клеток, которые трудно трансфицировать, электропорация является выгодной, однако гибель клеток более вероятна при использовании этого метода.
Этот метод использовался для доставки siRNA, нацеленного на VEGF, в ксенотрансплантаты опухолей у голых мышей, что привело к значительному подавлению
Эффекты подавления гена трансфецированной сконструированной миРНК обычно временны, но эту трудность можно преодолеть с помощью подхода РНКи. Доставка этой миРНК из ДНК-матриц может осуществляться с помощью нескольких рекомбинантных вирусных векторов на основе ретровируса, аденоассоциированного вируса, аденовируса и лентивируса. Последний является наиболее эффективным вирусом, который стабильно доставляет миРНК к клеткам-мишеням, поскольку он может трансдуцировать неделящиеся клетки, а также напрямую нацеливаться на ядро. Эти специфические вирусные векторы были синтезированы для эффективного облегчения siRNA, которая нежизнеспособна для трансфекции в клетки. Другой аспект заключается в том, что в некоторых случаях синтетические вирусные векторы могут интегрировать миРНК в геном клетки, что обеспечивает стабильную экспрессию миРНК и длительный нокдаун гена. Этот метод выгоден тем, что он in vivo и эффективен для трудно трансфицируемых клеток. Однако возникают проблемы, поскольку он может запускать противовирусные реакции в некоторых типах клеток, приводя к мутагенным и иммуногенным эффектам.
Этот метод потенциально может использоваться в подавлении генов центральной нервной системы для лечения болезни Гентингтона.
 | Викискладе есть медиафайлы, связанные с малой интерферирующей РНК. |
